siRNA沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC3细胞生物学行为及多西紫杉醇化疗及放疗敏感性的影响.pdfVIP

中文摘要 siRNA 沉默HIF-1 α基因对前列腺癌PC3 细胞生物学行为及多西紫杉醇化疗和放疗敏感性的影响 siRNA 沉默 HIF-1 α基因对前列腺癌PC3 细胞生物学行 为及多西紫杉醇化疗和放疗敏感性的影响 中文摘要 前列腺癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一，主要治疗手段有根治性手术和内 分泌治疗、放疗及化疗。根治术后局部复发或远处转移及许多无手术机会的患者，常 选择内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者，大多数起初有效，但经过中位时间 14～ 30 个月后，几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌，激 素治疗将不再有效。如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌依 然是基础和临床研究的热点和难点。RNA 干扰（RNAi ）是利用小RNA （包括小干扰 RNA 即siRNA ）序列抑制特定基因信号的过程，直到目前，尚未发现哺乳动物有内 源表达的 siRNA 。若能将人工合成的具有特定序列的siRNA 导入肿瘤细胞内，有可 能引起具有同源序列基因的mRNA 降解，从而有效地抑制该基因的表达，影响肿瘤 的生物学行为。近年来，RNAi 技术的发展为前列腺癌治疗的研究提供了一种新思路。 包括前列腺癌在内的肿瘤细胞对放化疗等治疗措施的敏感性与组织是否缺氧有 关。缺氧诱导因子-1 α（HIF-1 α）调控的众多下游基因参与了血管生成、血红蛋白 的合成、葡萄糖转运和糖酵解、细胞的增殖与凋亡等肿瘤乏氧适应的生物学过程。文 献报道和我们的前期研究证实：前列腺癌中HIF-1 α在mRNA 水平和蛋白水平均呈高 表达，且与前列腺癌的恶性生物学行为有关。本课题设计思路：首先，体外化学合成 7 条siRNA，通过脂质体包裹后转染前列腺癌PC3 细胞，观察HIF-1 α-siRNA 的干扰 效果，筛选出最有效的siRAN，然后用它来进行RNAi 以观察对PC3 细胞生物学行 为如生长增殖、侵袭迁移及凋亡等的影响，再联合多西紫杉醇化疗及放疗来观察 siRAN 沉默HIF-1 α对PC3 细胞化疗及放疗的敏感性的影响，以期为前列腺癌的治疗 提供一种新思路。 本研究分四个部分 第一部分：靶向人HIF-1 α基因的有效siRNA 序列的筛选及效果检测 II siRNA 沉默HIF-1 α基因对前列腺癌PC3 细胞生物学行为及多西紫杉醇化疗和放疗敏感性的影响 中文摘要 目的：设计、合成靶向HIF-1 α基因的siRNA序列，并筛选出最有效的序列，为 后续研究提供依据。 方法：针对人类HIF-1 α基因mRNA （NM_001530 ）序列设计并化学合成七条 siRNA及两条阴性对照序列。选择40nM作为siRNA的转染终浓度，转染后24 、48 、72 小时用Real-Time-PCR检测PC3细胞HIF-1 α-mRNA表达水平的变化；在siRNA转染后 48小时用western-blotting检测PC3细胞HIF-1 α蛋白表达水平的变化。 结果： 1号及5号序列HIF-1 α-siRNA转染24小时后的干扰效果在所有序列中较 好，mRNA抑制率均在70% 以上。HIF-1 α-siRNA干扰的时效性检测显示1号序列及5 号序列在mRNA水平干扰效果最佳的时间是转染后24~48小时。转染后48小时western blot检测HIF-1 α蛋白水平，结果显示序列1干扰效果最好，蛋白水平下降了70% 以上。 结论：7条HIF-1 α–siRNA 中，靶位点为792-812 的1号HIF-1 α-siRNA转染48小时 后在mRNA水平和蛋白水平的干扰效果均较好，抑制率均在70% 以上；因此确定用1 号HIF-1 α-siRNA来进行后续研究。1号HIF-1 α-siRNA最好的干扰效果可能发生在转 染后24~48小时左右。 关键词：PC3 细胞 HIF-1 α siRNA 筛选 第二部分：siRNA 沉默HIF-1 α基因对PC3 细胞生物学行为的影响 目的：探讨用1号siRNA （HIF-1 α-siRNA1 ）沉默HIF-1 α基因对前列腺癌PC3细 胞生物学行为的影响。 方法：实验分为PC3组、PC3+NC siRNA组和PC3+HIF-l α-siRNA1三组；采用脂 质