Scinderin基因在结直肠癌肝转移中的相关功能探究.pdfVIP

博士论文 Scinderin基因在结直肠癌肝转移中的相关功能研究 Scinderin基因在结直肠癌肝转移中的相关功能研究 摘 要 研究目的： 载体 2．探讨SCIN基因在结直肠癌组织中的表达与肝转移的关系。 3．寻找抗肿瘤治疗的新靶点。 研究方法： 1．利用基因芯片杂交技术筛选结直肠癌肝转移组与无转移组中差异表达的基 因，并用荧光定量PCR技术验证具有显著差异表达的基因。基因芯片和 RT-PCR试验结果均显示SCIN基因是其中较显著差异表达的基因。 框架DNA片断后，两端含酶切位点粘端，可以直接连入酶切后的RNA干扰慢 病毒载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆 先进行PCR鉴定，在进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的SCIN 基因RNA干扰慢病毒载体。 SCIN基因与目的载体分别进行酶切。酶切产物电泳回收后进行定向连接或者 交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再 对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功 的SCIN基因过表达载体构建 4．将各个靶点慢病毒颗粒以优化的条件感染培养的目的细胞，48∽72h后采用 Real—time 平检测SCIN基因的敲减(Knock Down)效率，选择mRNA水平对基因沉默70％ 的靶点为有效靶点。 5．将有效靶点的穿梭载体平行包装多盘病毒，收获的病毒上清进行纯化、浓缩， 并测定病毒滴度，得到高滴度的慢病毒颗粒大量感染细胞，培养之后进行后 续功能实验。 博士论文 Scinderin基因在结直肠癌肝转移中的相关功能研究 blot 结果显示SCIN敲降后两种细胞中SCIN的表达得到明显抑制。选取上述两 株细胞进行MTT和Transwell功能实验。 结果： 1． VshRNA片段与载体连接后，转化大肠杆菌，每个片段均挑取5个克隆进 列长度一致。 2．4对不同序列的siRNA．SCIN基因慢病毒表达载体DNA测序结果证实： 一段与SCIN基因siRNA模板核苷酸相同，说明我们已经将合成的双链DNA oligo插入到vshRNA载体中，成功构建了RNA干扰慢病毒载体。 功能基因片段及酶切后电泳条带片段大小与理论值一致，认为获得了SCIN 基因片段。PCR酶切产物与酶切真核表达载体连接，转化大肠杆菌后，PCR 产物大小740bp。获得的阳性克隆送测序，重组的SCIN基因过表达载体测 序与目标基因序列完全一致，说明我们已将合成的SCIN基因插入到真核表 达载体中，成功构建了SCIN基因过表达载体。 4． 从WesternBlot结果可以看出，KD3siRNA靶点对SCIN基因的表达有显著 TU枷。 点shRNA载体进行慢病毒包装。病毒滴度达2×109 5． MTT法检测结肠癌细胞SW480和DLD．1两株细胞的生长情况结果显示， 数量下降，到第5d与阴性对照组NC比较OD值显著降低，两组差异显著， 具有统计学意义(Po．05)。 6 博士论文 Scinderin基因在结直肠癌肝转移中的相关功能研究 siRNA．SCIN干扰组较NC组侵袭率显著降低(P0．05)。 结论： 本研究得出以下结论：1)本组实验成功的构建shRNA慢病毒载体及SCIN 基因过表达载体；2)本研究结果提示SCIN基因在结直肠癌组织中的表达上调 与肝转移相关；3)可能机制：SCIN基因在结直肠癌组织中的表达上调，导致丝 状肌动蛋白(F．aetin)解聚，丝状肌动蛋白解聚导致细胞骨架改变，进一步导致结 直肠癌肝转移的发生。4)SCIN基因将来可作为预测结直肠癌肝转移的指标，亦 可作为抗肿瘤治疗的新靶点。 关键词：结直肠癌肝转移；基因芯