多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海贫血单细胞诊断中的应用探究.pdfVIP

多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海贫血单细胞诊断中的应用研究 多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海 贫血单细胞诊断中的应用研究 硕士研究生 陈晓林 指导老师 孙筱放 教授 中文摘要 β地中海贫血和脊髓性肌萎缩是两种常见的单基因遗传病。其中β地中海贫 血是是我国南方常见的一种常染色体隐性遗传、血红蛋白异常性疾病，携带率约 为2.8% 。该病由于珠蛋白基因缺失或突变导致。β珠蛋白基因簇位于人 11 号染 色体上，包含5 个功能基因和1 个假基因，这些基因的突变导致血红蛋白合成异 常而发病。全世界约发现200 多种突变，我国大约有28 种突变。地贫基因的突 变会导致贫血及后续的器官损害，严重危害人的生命。SMA 是一种常见的致死 性常染色体隐性遗传性疾病，其发病率约 1/6000-1/10000 。人群携带率约 1/40-1/50。染色体 5q13 的脊髓性肌萎缩运动神经元生存基因(survival motor neuron gene 1, smn 1) 的缺失是导致SMA 发病的主要病因。Smn 1 基因的突变使 脊髓运动神经元退变而导致肌无力和肌萎缩，由于肌肉渐进性的退化，患者走路、 爬行、吞咽、甚至呼吸等功能都会逐渐丧失，常因呼吸衰竭而死亡。上面两种疾 病至今仍缺乏有效的治疗方法。现在一般使用产前诊断的方法来减少患儿的出 生。然而，产前诊断需要终止妊娠，给孕妇及家庭带来巨大的伤害。 胚胎植入前诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是一种基于试管婴 儿的技术发展起来的不同于产前诊断的诊断方法。PGD 通过对体外授精形成胚 胎进行细胞活检，使用 PCR 或者荧光原位杂交等技术，进行遗传病的诊断，根 据结果移植合适的胚胎到宫腔中的一种技术，这种技术可以避免产前诊断所需要 的终止妊娠。根据欧洲人类生殖与胚胎协会PGD 分会的统计，目前全世界实行 PGD 周期总数超过20,000 例，成功分娩6,000 多个健康胎儿。为许多患者夫妇 带来了希望。 2 多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海贫血单细胞诊断中的应用研究 已经有许多对β地中海贫血和 SMA 进行植入前诊断的报道。如通过使用 单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、荧光PCR(Fluorescence PCR, F-PCR) 、巢 式 PCR 、连锁分析结合微小测序等方法进行β地中海贫血的单细胞诊断和植入 前诊断；通过限制性酶切、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR, AS-PCR) 、 荧光PCR(Fluorescence PCR, F-PCR) 、微小测序等方法进行SMA 的植入前诊断。 然而上述的方法都基于单细胞诊断技术，因此具有一些缺点，如只能同时扩增少 量基因位点、样本不能保留、每种反应体系都需要进行优化、高等位基因脱扣率 (allele drop out, ADO)等。 为了解决这个问题，全基因组扩增技术(whole genome amplication, WGA)用 于扩增单细胞全基因组DNA 已经引入到PGD 之中。WGA 的方法有许多种，如 引物延伸预扩增聚合酶链反应(primer extension preamplification PCR, PEP-PCR)， 简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR) ，多重链置换扩增(multiple displacement amplification, MDA) 等。 PEP-PCR 和DOP-PCR 都是基于PCR 为基础的，因此其具有基因组覆盖不完全 高ADO 率、扩增片段短不适用于需要高质量模板的后续基因分析方法等缺点。 MDA 是目前为止最好的WGA 方法。其最早由Lizardi 博士建立，主要基于Phi29 DNA 聚合酶的恒温链置换扩增原理，具有恒温扩增、扩增片段长、基因组覆盖 度高等优点。 研