雌激素通过MAPK信号通路刺激内皮祖细胞的增值及迁移.pdfVIP

目 录 1 雌激素通过MAPK 信号通路刺激内皮祖细胞增值和迁 移„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1.1 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1.2 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 1.3 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 1.4 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„13 1.5 结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19 1.6 讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 1.7 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38 1.8 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39 1.9 英汉缩略词对照表„„„„„„„„„„„„„„„„46 2 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„47 3 内皮祖细胞与MAPK 信号传导通路 （综述） „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„48 2 雌激素通过MAPK 信号通路刺激内皮祖细胞的 增值和迁移 摘 要 目的：观察丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）及其亚族细胞外信号调节 激酶 （extracellular-signal regulated protein kinase ERK ）、c-Jun 氨基末 端激酶（JNK ）/应激激活蛋白激酶（SAPK ）、p38 在雌激素刺激内 皮祖细胞 （EPCs ）迁移和增值中的作用。方法：（1）单个核细胞的 分离：用 50U/ml 肝素 2ml 润湿空针后抽取脐带血约 50ml，加入3% 明胶16ml （脐带血:明胶=3:1）沉淀后加入人淋巴细胞分离液用密度 梯度离心法分离出单个核细胞，活力计算活性达98%可以接种。（2） 诱导分化：成纤维细胞多于24 小时内贴壁，因此培养24 小时后取未 6 2 贴壁细胞以4×10 /cm 接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养板(每 孔lml)，每孔中加入M199 培养液lml，添加10%胎牛血清、1%青链 霉素(1万单位/ml)、VEGF （50ng/ml），置于5%CO 、饱和湿度37℃ 2 孵育箱中培养，换培养液培养至 7d，贴壁细胞供实验用。（3）EPCs 鉴定：培养细胞爬片后，然后分别加入鼠抗人 CD133 单克隆抗体 (1:100稀释)、DiI-ac-LD 、FITC-UEA-1 分别在倒置相差显微镜及免 疫荧光显微镜下观察拍照。（4）实验分组：本实验共分五组，分别为 对照组：正常培养EPCs 未加入任何药物；雌二醇（E ）组：EPCs 培 2 养 7 天后加入 E2 ；PD98,059(ERK 抑制剂)组：培养 7 天后先用 PD98,059 作用细胞24h 再加入E2 ；SP600125 （JNK 抑制剂）组：培 1 养 7 天后先用 SP600125 作用细胞 24h 再加入 E2 ；SB203580 （p38 抑制剂）组：培养7 天后先用SB203580 作用细胞24h 再加入E 。（5 ） 2 观测指标：①酶联免疫检测仪检测各组活细胞数（结果以吸光值表 示）。②选取特定浓度用流式细胞检测仪分析各组细胞周期变化。③ 将细胞悬液种在Traswell 小室上层，下层加入趋化因素，观察由上层 小室迁入下层