外周神经损伤对中枢核团的影响和骨髓间充质干细胞治疗外周神经损伤后中枢逆行性病变的可行性研究.pdf

擅±堂位i金塞电塞摘要 中文摘要 第一部分外周神经损伤后中枢核团的逆行性病变 目的 建立大鼠单侧迷走神经离断模型，观察建立模型后不同时间点迷 走神经中枢背核神经元的变化，包括神经元形态学和数量的变化；观 察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核诱导型一氧化氮合成酶 建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核单核细胞趋化蛋白一1 (MCP．1)的表达，以此来观察外周神经损伤后除了神经损伤部位的 功能和生化发生改变外，损伤神经的更高位的通路比如脊髓和中枢核 团是不是也会发生逆行性的改变，并初步探讨神经递质NO在迷走神 经损伤后中枢背核逆行性病变中的意义及炎性细胞因子MCP．1在中 枢背核逆行性病变中所起的作用。 方法 (O．3n11／l【g)，腹腔内注射麻醉，固定大鼠，在颈部分离出左、右迷走 神经，离断右侧迷走神经，左侧迷走神经则不做处理，随后缝合切口。 对照组大鼠只分离出左、右迷走神经，但均不予切断，随后缝合切口。 2．选择健康雄性SD大鼠，按方法1建立迷走神经离断模型，分 别于术后ld、5d、10d做进一步研究，每组3只大鼠，每只大鼠5片 切片。用10％水合氯醛深度麻醉大鼠后，即刻打开胸腔，显露心脏， 经左心室插入灌注管，快速肝素化，剪开右心耳，快速灌注4℃冰生 理盐水150lnl，再以409／L多聚甲醛行心脏灌注，灌注结束后开颅取 攫±堂位论塞 虫塞翅噩 脑，解剖出脑干，标本收集于409／L多聚甲醛液中过夜，然后置20％ 蔗糖多聚甲醛浸泡3．O一4．Oh，再置30％蔗糖磷酸缓冲液浸泡沉底，4℃ 保持12h，随之取出用冰冻组织包埋剂包埋后置于液氮冷冻固定，随 后用Leica全自动冷冻切片机切片，片厚20肛m，切片放置室温下lh干 燥固定后置于-20℃恒温冰箱保存。 3．取右侧迷走神经离断后1d、5d以及对照组大鼠左、右侧冰冻 脑干切片，置于甲酚紫染色液(CFV)中行尼氏染色，观察建立模型 后不同时间点背核区神经元细胞的组织形态学改变并行神经元计数。 4．取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰 冻脑干切片，行一步法1rI胍L荧光染色，观察建立模型后不同时间 点背核区神经元有无凋亡发生。 5．取右侧迷走神经离断后5d、lOd以及对照组大鼠左、右侧冰 冻脑干切片，行免疫组织化学染色，观察建立模型后不同时间点背核 区iNOS和NADPH的表达变化。 6．取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰 冻脑干切片，行免疫组织化学染色，观察建立模型后不同时间点背核 区MCP．1的表达变化。 复士甲 ：日木 1．1背核神经元的免疫组化观察 对照组大鼠左、右侧背核神经元形态完整，以大中型细胞为主， 分布均匀，形态规则，大多数神经元呈椭圆形或锥体形，部分神经元 可见突起分支，胞质轻微染色，胞核未见明显显色；有少量较小的神 经元细胞，形态规则，结构完整。 迷走神经离断后ld左侧背核神经元形态和分布与对照组相比， 除染色稍微深之外无明显差异；但在右侧背核区，大多数神经元染色 Il 熊±堂僮论塞 虫塞翅蕉 明显加深，不均匀分布，其中较大的神经元大多数明显皱缩，突起缩 短或消失，胞质深染，部分神经元的胞核消失，部分较小神经元也表 现出同样的变化，但神经元细胞的数量与对照组相比未见明显减少。 迷走神经离断后5d左侧背核区神经元与对照组相比无明显变 化，但在右侧背核区，神经元数量较左侧及对照组相比则明显减少， 并有较多深染、胞膜皱缩的较小的神经元出现。 1．2背核神经元计数 为确认迷走神经离断后背核区神经元的死亡情况，模型组和对照 组大鼠每只选5个切片，计数神经元数量。对照组大鼠左、右侧背核 神经元计数分别为53士4／片和51士5／片；建立模型后1d大鼠左侧背核 神经元数量为52士4，与对照组比无统计学意义，而右侧背核神经元 数量为46士3，与对照组及同时间点左侧相比数量明显减少(pO．05)； 建立模型后5d左侧背核神经元计数为51士6／片，与对照组比无统计学 意义，而右侧背核神经元数量为35士5／片，与对照组及同时间点左侧