小鼠DND1慢病毒载体的构建和病毒生产.pdfVIP

摘要 目的：在本研究中，将用PCR法从小鼠10．5d胚胎cDNA文库中扩 增出的Dndl基因引入慢病毒载体系统，并生产Dndl慢病毒颗粒。 为进一步明确Dndl体外生物学功能奠定基础。 方法： 1．Dndl基因的获得 软件设计基因的特异引物Dndl—AgeI-F和Dndl—AgeI—R，并且引入 Age Dndl基因。PCR法筛选阳性克隆。 2．重组慢病毒载体转移质粒pGC—FU—Dndl的构建 I酶切回收后的PCR产物交换连接 采用In—Fusion技术，将Age 入Age DH5a感受态细胞，扩增质粒。 连接产物质粒转化大肠杆菌E．coli 3连接产物pGC—FU—Dndl的酶切鉴定 收集部分扩增后连接产物质粒，酶切后经电泳证实所得片段长度 均与预期相符，说明Dndl基因己克隆成功。基因测序结果亦证实成 功克隆Dndl基因。 4连接产物pGC—FU—Dndl质粒转染293T细胞 用脂质体Lipofectamine2000包裹构建的pGC—只『-一dndl和辅助 病毒颗粒。 结果： 片段。 (BC034897)比较，表明Dndl基因序列及读码框均正确。 93 3三质粒转染2 T细胞后荧光显微镜观察结果及Western—blot检 测鉴定表明成功建立Dndl慢病毒表达载体系统。 结论： 1成功克隆小鼠Dndl基因和成功构建pGC—FU—Dndl质粒 2 绿色荧光蛋白的表达：经Western 293T细胞中的表达，从而证明我们成功建立了Dndl重组慢病毒， 对其进行纯化后采用逐孔稀释法测定滴度，滴度测定结果为2E+9 TU／ml。这为更深入的探讨Dndl基因抑制细胞增殖中等体外细胞 生物学功能提供实验基础。 关键词：慢病毒，载体，DNDl，基因 Ⅱ ABSTRACT Inthis willmakean to Dndl Objectivestudy,we attemptput gene from10．5d’S cDNAofmouseintolentiviralvector coming embryo will establisha foundationfor outthe system，which strong working functionofthe Dnd1． biological proteinexpressedby MethodsTheDNA ofDndl was fragment codingsequence from10．5d’S cDNAPCR with amplified embryoby designedprimer, andthensubclonedinto vectorwithIn—Fusion to pGC—FU technique thelentiviral 1．The generate expressionvector,pGC—FU—Dnd cloneswerescreenedPCRandthecorrectDndl