小鼠早期胚胎H3K4甲基化表达水平探究.docVIP

小鼠早期胚胎H3K4甲基化表达水平探究【中图分类号】 R-33 【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)04－0252－02 【摘 要】目的：研究小鼠早期胚胎各发育阶段组蛋白H3K4单和双甲基化的变化过程。方法：准备受孕母鼠，获取小鼠各阶段正常早期胚胎，通过4%多聚甲醛固定，0.4%triton透膜，0.1%牛血清白蛋白封闭，抗H3K4单双甲基化一抗染色处理，二抗避光孵育后，利用免疫荧光技术，对各个阶段早期胚胎组蛋白H3K4单和双甲基化表达水平鉴定。结果：成功得到所需要的各发育阶段的正常早期胚胎。发现：从1细胞胚胎到8细胞胚胎组蛋白H3K4单和双甲基化表达水平整体呈下降趋势，在1细胞胚胎达到最高，8细胞胚胎表达水平最低，桑葚胚和囊胚较8细胞胚胎表达水平又有所回升。结论：在早期胚胎发育过程中，组蛋白H3K4单和双甲基化程度成逐渐下降趋势。 【关键词】小鼠早期胚胎；组蛋白H3K4；甲基化；表观遗传修饰 表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变［1］。这种改变是细胞内除了遗传信息以外其他可遗传物质发生的改变,即基因型未发生变化而表型却发生了改变,且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递［2-3］。其修饰方式主要有DNA甲基化，去甲基化和组蛋白乙酰化。它们对于早期胚胎和配子的形成和发育、组织特异性基因的表达、大部分基因沉默(gene silencing)起关键作用，在正常细胞过程，比如雌性哺乳动物X染色体失活，以及酵母中配对型位点的沉默方面也有重要作用［4］。 组蛋白修饰是表观遗传学里主要修饰方式之一，到目前为止，在组蛋白上至少发现有八种不同的修饰方式，我们了解比较多的是乙酰化、甲基化和磷酸化这样比较小的共价修饰。近几年的研究发现，H3K9的甲基化与基因的沉默有关，而H3K4的甲基化却可以使基因活化且H3K4的甲基化可招募HP1或其同源物与之结合，从而使基因所在部位异染色质化，这表明，组蛋白的甲基化可能与异染色质的形成有关［9-11］。H3K4位点发生的甲基化可以激活基因的转录，其必须在H2B的123位赖氨酸呈现泛素化的状态下进行，根据以往研究表明，H3K4甲基化可能是转录发生的早期事件，由于这种修饰在多细胞动物中是异常复杂的，因此研究H3K4单和双甲基化的具体功能更具有重要的意义。 本实验中，我们研究了组蛋白H3K4单和双甲基化对小鼠早期胚胎各阶段动力学变化过程, 有助于揭示表观遗传学对哺乳动物早期胚胎基因表达、调控、遗传的重要作用。? 1 实验材料和方法 1.1 实验试剂：孕马血清（PMSG）,购自宁波激素制品厂；人绒毛膜促性腺激素（HCG，宁波激素制品厂）；胰酶消化液（Sigma）；4%多聚甲醛（Sigma）；0.4%triton（Sigma）；0.1%BSA(牛血清白蛋白)；一抗（兔抗鼠H3K4单和双甲基化，Abcam）；二抗（羊抗兔，Santa cruz）；PBS磷酸缓冲液。 1.3 小鼠的超数排卵及交配：选择6～8周龄健康昆白小鼠，并进行光照控制：6：00～ 2O：O0光照，2O：O0～6：00黑暗。16：00-17：OO时雌鼠腹腔注射PMSG10IU(宁波激素制品厂)，48h后再注射hCG10IU(宁波激素制品厂)，然后将其与雄鼠2：l合笼交配。次日早上8点之前检查阴道栓，有乳白色或者黄色冻胶物（阴道栓）即确定为怀孕，见栓当天上午确定为怀孕0.5天。同样方法取分别怀孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠进行实验。 1.4 小鼠早期胚胎的获取：取分别怀孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠，将母鼠置于超净工作台上，对其进行断颈处理，用手术剪剪开腹部，暴露子宫。用镊子和细针将子宫连同卵巢同其余组织分离，然后置于盛有PBS的培养皿内。用无钙镁PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。将培养皿置于倒置显微镜下，用细针分离卵巢和子宫周围的脂肪组织。1细胞的获取：用镊子固定子宫一端，取细针戳破输卵管的壶腹部，暴露1细胞，用自制吸取胚胎工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。2-8细胞的获取：剪去卵巢，用镊子固定子宫一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宫，冲洗输卵管，待胚胎被PBS液冲出后，用工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。桑葚胚，囊胚的获取：剪去输卵管和卵巢，用镊子固定子宫一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宫，冲洗子宫，待胚胎被PBS液冲出后，用工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。 1.5 染色与细胞组蛋白H3K4甲基化的检测：除1细胞需经过胰蛋白酶消化去掉胚胎上的颗粒细胞外，其余都同下步骤。用4%多聚甲醛固定胚胎3