hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列载体构建及鉴定.docVIP

hNaDC1基因5侧翼区转录调控序列系列载体构建及鉴定 　 作者：张剑凯，杨聚荣，李雪鹏，何娅妮 【摘要】 　　目的构建hNaDC1基因5侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5侧翼转录调控区不同长度片段：hNaDC1A（-2 232/+136，2 368 bp）、hNaDC1B（-1 640/+136，1 776 bp）、hNaDC1C（-1 084/+136，1 221 bp）、hNaDC1D（-253/+136，389 bp）、hNaDC1E（-2 232/-12，2 244 bp），以pGL3Basic为载体构建hNaDC1基因5侧翼序列系列缺失质粒。重组体通过特异限制性内切酶酶切鉴定，并送样测序鉴定。结果成功构建hNaDC1基因5侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体5个：pGL3hNaDC1A～E。结论为进一步研究NaDC1基因5侧翼区转录调控元件的分布特点及转录调控元件与转录因子间的相互作用提供了基本实验条件。 【关键词】 hNaDC1基因　基因表达调控　载体构建 Abstract: Objective To construct the firefly luciferase report gene vectors for 5 flanking regulated elements of hNaDC1 gene. MethodsThe DNA fragments hNaDC1A~E(-2 232/+136) in 5’flanking region of hNaDC1 gene were amplified from the nephridial tissue by using PCR. The PCR products were directionally subcloned into pGL3Basic vector. The recombined clones were identified by agarose gel electrophoresis after restriction endonuclease digesting and DNA sequencing. Results 5 expression vectors(pGL3NaDC1A~E)for 5’ flanking regulated elements of hNaDC1 gene had been constructed. ConclusionThese expression vectors offer the basic experimental conditions for studying the distribution characters of hNaDC1 gene 5’ flanking regulations elements and the properties of interactions between the elements and regulation proteins with the help of dual luciferase report gene assay system. Keywords: hNaDC1 gene; regulation of gene expression; construction vector 人钠离子依赖性二羧酸协同转运蛋白1（human Na+/dicarboxylate cotransporter 1，hNaDC1）是负责转运三羧酸循环中间代谢产物琥珀酸、枸橼酸和α酮酸等有机阴离子的低亲和力跨膜转运蛋白，主要分布于肾脏近端小管和小肠的刷状缘［1］。目前认为，钠离子依赖性二羧酸协同转运蛋白参与机体能量代谢、酸碱平衡调节以及哺乳类动物寿限的调控等重要生命活动，可能与肾结石、代谢性酸中毒和衰老等病理生理过程密切相关［25］。然而迄今为止，hNaDC1基因的表达调控机制尚不清楚。本研究以萤火虫荧光素酶报告基因质粒为载体构建了hNaDC1基因5侧翼转录调控序列系列缺失质粒，为进一步研究hNaDC1基因转录调控机制奠定基础。 1材料与方法 1.1细菌菌株、质粒及主要试剂 E.coli JM109为第三军医大学野战外科研究所创伤烧伤复合伤国家重点实验室留存。萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic、限制性内切酶Kpn I和Hind III购自Promega公司；Pfu高保真DNA聚合酶及相关PCR试剂购自Stratagene公司；T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega公司。琼脂糖、琼脂粉、酵母提取物及胰蛋白胨为Sigma公司产品。 1.