cerbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用.docVIP

cerbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制作用 　 作者：吴永忠,任庆兰,李少林 【摘要】 　　目的 探讨cerbB2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。 方法 实验分空白对照组、正常对照组、cerbB2正义对照组及cerbB2反义 治疗 组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。 结果 反义治疗组与正义对照组比较：转染72h OD值分别为0.201与1.298（P＜0.01）；克隆形成率分别为26.5%与76.5%（P＜0.05）；凋亡率分别为21.3%与7.5%（P＜0.05），同时明显地下调cerbB2蛋白质的表达水平（P＜0.05）。结论 在卵巢癌的基因治疗中，cerbB2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。 【关键词】 SKOV3细胞　反义寡核苷酸　卵巢癌　cerbB2基因 Inhibitory Effects of cerbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides Transfection on the Human Ovarian Carcinoma SKOV3 Cell Lines . Key words：SKOV3 cell lines;Antisense oligodeoxynucleotides;Ovarian carcinoma;cerbB2 gene 　卵巢癌已成为女性生殖系统恶性肿瘤死亡的首位原因。美国每年新发病率达到23 000例左右［1］。其总的5年生存率不到30%[2]。近30年来，卵巢癌发病率上升了3倍，治疗手段虽有改进，疗效却仍然不令人满意。有作者指出生物治疗在卵巢癌的治疗中将起关键性的作用[3]，在分子水平上控制卵巢癌的发生 发展 可能成为最大的希望。本课题采用cerbB2反义寡核苷酸联合转染的方法，通过一系列实验，在细胞水平观察它们对人卵巢癌SKOV3细胞株增殖的抑制作用及其初步分子机制。 论文代写 1材料与方法 论文代写 1.1材料 SKOV3细胞株购自重庆医科大学基础医学院肿瘤 研究 室。阳离子脂质体（lipofectin）购自美国sigma公司。cerbB2正义脱氧寡核苷酸（SODN）序列为：5′GGTTCACACGTGGCC3′，cerbB2 ASODN序列为5′CCAAGTGTGCACCGG3′[4]。所有SODN与ASODN均由上海生物 工业 公司合成并全部经硫代磷酸化修饰。RPMI1640培养基、小牛血清、各种抗体等试剂均购自美国hyclone公司。转染液为自制的无血清无抗生素RPMI1640培养液。实验所用仪器均由重庆医科大学分子生物学实验室提供。 毕业论文 1.2方法 1.2.1细胞培养SKOV3细胞在37℃、5%CO2条件下、含10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。传代培养时，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化2～5min后，用RPMI1640培养液终止消化，在低速离心机上1 500r/min离心5min，弃上清，再用PBS液重悬细胞，再离心5min。利用ELX800微孔板读数仪调整细胞浓度后，接种到新的培养瓶。 1.2.2实验分组 共设立4组：0组:空白对照组，仅予以转染液处理;I组:正常对照组，阳离子脂质体lipofectin + 转染液;Ⅱ组:正义治疗组，cerbB2 SODN + lipofectin + 转染液;Ⅲ组:反义治疗组，cerbB2 ASODN+ lipofectin + 转染液。 1.2.3脂质体转染方法按照产品说明书进行，脂质体与寡核苷酸的比例为1∶4。 毕业论文 1.2.4MTT试验脂质体转染20h后再分别培养24、48、72h。培养48h时换液一次。到相应终止时间，弃原培养液，每孔加入转染液90μl，再加入MTT（5mg/ml）10μl，放入CO2孵箱中孵育4h。弃上清，每孔加入DMSO 100μl，震荡10min。酶联免疫检测仪570nm波长比色。 1.2.5平板集落形成试验脂质体转染20h后，吸去上清液，用0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为103/ml。取9cm培养皿24个，每组3个平行皿，分别预置10ml普通培养液，做好分组标志。每皿接种单细胞悬液各200μl，即细胞数为200个/皿，然后十字方向轻巧晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿移入CO2孵箱中，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，静止培养2.5周。肉眼下计数细胞