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OX40-OX40L共刺激分子在肝移植急性排斥反应中作用实验探究 　作者：胡曼丽范恩学孙海侠王焕丽 【摘要】目的探讨共刺激分子途径在免疫耐受的作用机制。方法制作大鼠肝移植模型，应用抗CD134抗体+雷帕霉素联合药物抑制急性排斥反应的发生。结果空白对照组：SD对Wistar组存活时间因有排斥反应致存活时间短；移植治疗对照组：单纯抗CD134组与单纯雷帕霉素组，其中SD对SD组和Wistar组对Wistar组大鼠间肝移植因未见明显的排斥反应，存活时间长，MHC完全不匹配的SD对Wistar组存活时间短，前两者（SD对SD组和Wistar组对Wistar组）和后者（SD对Wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异；抗CD134抗体与雷帕霉素联合治疗组：SD对SD组，Wistar组对Wistar组因未见明显的排斥反应及封闭了共刺激途径，存活时间一样长，前两者（SD对SD组、Wistar组对Wistar组）和后者（SD对Wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异，结果显示抗CD134抗体与雷帕霉素联合治疗组抑制移植效果最佳。结论应用抗CD134抗体+雷帕霉素可以诱导免疫耐受的产生。 【关键词】共刺激分子肝移植急性排斥反应抗CD134抗体免疫耐受 研究免疫耐受诱导的方案很多，由于是单一途径刺激，效果不好。许多学者开始提出多途径协同刺激方案。抗CD134基因工程抗体可用来封闭OX40-OX40L共刺激相关分子,影响细胞活化，诱导免疫耐受的产生。 1材料与方法 1.1抗体来源我们从美国SIGMA公司引进抗CD134基因工程抗体1000mg/ml和抗大鼠IL-a、TNF、IFN抗体。 1.2实验分组选取MHC（组织相容复合体）完全不匹配的雄性SD大鼠（供体）、8-10周龄、体重200-240g。雄性wistar大鼠（供体）、8-12周龄、体重200-240g。由吉林大学实验动物（清洁级动物）提供，随机分成10组，每组8只，供肝脏移植用。10组分别于3天、6天、9天、12天、16天、20天给药：对照组腹腔注射生理盐水；2、3、4组注射抗大鼠CD134抗体0.5mg/只；5、6、7组肌肉注射雷帕霉素1mg/kg/d/只；8、9、10组给雷帕霉素1mg/kg/d/只和抗大鼠CD134抗体0.5mg/只。 1.3大鼠肝脏移植术式采用腹腔原位肝脏移植法。大鼠麻醉采用30mg/kg戊巴比妥腹腔注射。麻醉生效后，分别切除受体肝脏，用7-0Proleme-连续端端吻合肝脏上下腔静脉（IVC），用套管法吻合门静脉（PV），胆管重建采用Stent端端吻合法。移植肝脏冷血时间为30min之内。移植手术是否成功判断标准为术后关腹前观察移植肝脏血运情况。完全血运且无渗血为移植模型成功。 1.4HE染色及免疫组化染色 1.4.1HE染色方法切取移植的肝脏组织，石腊切片脱蜡和水化后蒸气水洗；哈瑞氏苏木精浅染核5分钟；自来水冲洗；1%盐酸酒精分化—自来水冲洗；0.1%弱氨水返蓝—自来水充分冲洗—蒸气水洗；伊红染,15分钟；常规脱水,透明,封片。常规切片，HE染色镜下观察。 1.4.2免疫组化制备（SABC法）实验抗大鼠IL-a、TNF、IFN抗体按说明书进行。一抗的工作稀释度均为1∶400，为阴性对照。将目镜配上10×10计数格，在高倍镜下随机选择4个视野，计数4个视野的平均阳性细胞数。细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，分别表示如下：棕黄色-+++，黄色-++，淡黄色-+，无色为阴性,表示计量分析将组化片扫描图像输入计算机，采用计算机图像分析软件计数浸润的炎症细胞数量。 　2结果 2.1抗大鼠IL-a，TNF、IFN抗体免疫组化细胞浆内出现棕黄色颗粒情况，分别表示如下：空白对照组未出现；抗CD134抗体治疗组和雷帕霉素治疗组各出现较少，经T检验，抗CD134抗体治疗组和雷帕霉素治疗组两组间无统计学差异；抗CD134抗体治疗组和雷帕霉素联合组最多，分别和抗CD134抗体治疗组、雷帕霉素治疗组有统计学意义。其中以SD对Wistar组最为明显。说明联合组抑制共同刺激途径效果最好。 2.2各组肝移植后大鼠存活时间（天）空白对照组：SD对Wistar组存活时间因有排斥反应致存活时间短；移植治疗对照组：单纯抗CD134组与单纯雷帕霉素组其中SD对SD组和Wistar组对Wistar组大鼠间肝移植因未见明显的排斥反应，存活时间长，MHC完全不匹配的SD对Wistar组存活时间短，前两者（SD对SD组和Wistar组对Wistar组）和后者（SD对Wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异。抗CD134抗体与雷帕霉素联合治疗组，SD对SD组，Wistar组对Wistar组因未见明显的排斥反应及封闭了共刺激途径，存活时间一样长，前两者（SD对SD组、Wista