IL1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、 Ⅲ型胶原及TIMP1 mRNA表.docVIP

IL1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、 Ⅲ型胶原及TIMP1 mRNA表 　 作者：邓存良, 黄捷, 陈文, 王明勇, 陈枫 【摘要】 　　目的: 研究白细胞介素1受体拮抗剂（IL1ra）对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、 Ⅲ型胶原（ColⅢ）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）基因表达的影响, 探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。方法: 原位分离、 培养大鼠HSC, 荧光显微镜观察及免疫细胞化学染色法鉴定。用1 μg/L、 10 μg/L、 100 μg/L3个浓度的IL1ra分别作用于HSC 48 h, 实时荧光定量RTPCR法检测ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达。结果: 对照组ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、 2.70±0.57、 3.83±0.30。加入1 μg/L、 10 μg/L、 100 μg/L IL1ra后ColⅠ 基因表达水平依次为1.34±0.35、 0.86±0.19、 0.35±0.03; ColⅢ基因表达水平依次为2.02±0.29、 1.13±0.09、 0.47±0.11; TIMP1 mRNA的表达水平依次为3.12±0.25、 2.53±0.38、 1.98±0.18, 与对照组比较, 不同浓度处理组ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达均明显降低（Plt;0.05）。结论: IL1ra以剂量依赖方式抑制HSC中ColⅠ、 ColⅢ及TIMP1 mRNA的表达, 具有抗纤维化作用。 【关键词】 肝星状细胞 白细胞介素 1受体拮抗剂 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 基质金属蛋白酶组织抑制因子 1 　　肝纤维化是所有慢性肝病共有的病理改变。IL1是纤维化形成过程中重要的细胞因子。可以活化肝星状细胞（hepatic stellar cell, HSC）, 进而促进其分泌Ⅰ、 Ⅲ、 Ⅳ型胶原、 层黏连蛋白等多种细胞外基质成分及基质金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs), 从而促进肝纤维化的发生发展。我们的前期工作表明白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin Ⅰ receptor antagonist, IL1ra）可抑制肝纤维化大鼠星状细胞的增殖和胶原的合成, 减少肝脏细胞外基质的沉积［1］。有研究发现IL1β受体拮抗剂可降低TIMP1 mRNA的表达［2］。本试验的目的是系统观察IL1ra对HSC表达Ⅰ型胶原（CollagenⅠ, ColⅠ）、 Ⅲ型胶原（CollagenⅢ, ColⅢ）和TIMP1基因的影响, 探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 Wistar雄性大鼠(质量450～500 g), 购自第三军医大学西南医院实验动物科。IL1ra 由北京大学医学部马大龙教授惠赠; 鼠抗人结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自DAKO公司; 实时荧光检测试剂盒购自美国BioRad公司; PCR引物由上海生物工程公司合成部合成; 总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司; RTPCR试剂盒购自TaKaRa（日本）公司; Realtime PCR仪、 Doc2000型凝胶成像系统购自美国BioRad公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠HSC的分离、 培养及鉴定 参照翁山耕等［3］的方法。Wistar大鼠禁食禁水12 h, 20 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉, 切开腹腔, 用留置针头穿刺门静脉。37℃预灌注液以10 mL/min 的速率灌注约10 min, 当整个肝脏变成黄色时, 换用37℃含Ⅳ型胶原酶溶液灌注至整个肝脏几乎呈液状。将肝脏从大鼠腹腔中切除, 去除肝包膜及结缔组织, 剪碎肝组织, 倒入一预装有50 mL振荡消化液烧瓶, 再加入含0.6 g/L CaCl2的DHanks液至100 mL, 37℃振荡消化30 min, 所得细胞悬液依次经150目、 200目金属网过滤, 滤液收集于离心管。500 g离心7 min, 弃上清。每管加入40 mL RPMI1640培养液, 反复吹打, 使细胞充分混匀。50 g离心2 min（20℃）, 反复2次, 弃沉淀。上清液500 g离心7 min（20℃）, 弃上清, 沉淀用RPMI1640培养液500 g离心冲洗2次。加入RPMI1640液12 mL、 330 g/L Nycodenz 液各6 mL, 充分混匀, 将细胞悬液分装入10 mL离心管。在细胞悬液上小心滴加一层RPMI1640培养液, 1500 g离心