不同时间脾切除联用环孢素对协调性异种心脏移植物存活影响.docVIP

不同时间脾切除联用环孢素对协调性异种心脏移植物存活影响 　 作者：王博，吕毅，张晓刚，李晖，仵正，潘承恩 【摘要】 目的 探讨脾切除联用环孢素对协调性异种移植心脏存活时间的影响及其机制。方法 建立协调性异种心脏移植模型。分别采用不同时间脾切除联用环孢素，观察异种移植物的生存时间。用CH50法检测各组动物血清中总补体活性。应用流式细胞技术检测动物血清中异种反应性抗体IgG、IgM的滴度变化。移植物标本HE染色观察病理学改变。免疫组化染色观察各实验组不同时间移植物组织中IgG、IgM抗体的沉积。结果 脾切除联用环孢素能够显著延长移植物的生存时间(Plt;0.05)，降低受者体内异种反应性抗体的滴度。结论 脾切除联用环孢素可以减少移植术后早期受者体内异种反应性抗体的产生，延长异种移植物的生存时间。 【关键词】 异种移植；环孢素；心脏移植 同种异体器官移植成为终末期肾脏、心脏、肝脏等疾病的常规治疗手段，已经为越来越多的患者所接受。但是，人类供体器官缺乏一直困扰着器官移植的发展。用合适的动物作为器官供体，可能成为解决器官缺乏的有效手段之一。自20世纪60年代起，人们用非人类器官进行异种移植的尝试以来，已经进行了肾、心、肝脏等器官异种移植。但是，异种移植的免疫排斥反应较同种移植更为强烈。协调性异种移植(concordant xenotransplantation)中，移植物虽不发生超急性排斥反应，但是在移植术后3-4d内将会发生急性血管排斥反应(acute vascular rejection, AVR)。近年来研究发现，诱生型异种反应性抗体(elicited xenotractive antibody, EXA)在AVR中起到重要作用。EXA结合于移植物血管内皮细胞上，激活补体、活化血管内皮细胞，产生一系列黏附分子和前炎症细胞因子，最终导致移植物被排斥[1]。因此，通过调节移植术后早期EXA的产生可能延缓或减轻排斥反应的发生。本试验中，我们将通过不同时间脾切除联用环孢素对受者进行干预，观察异种移植物在受者体内的存活情况，初步探讨异种反应性抗体在异种排斥反应中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与分组 　　供体为健康成年金黄地鼠70只，80-100g，雌雄不拘。受体SD大鼠70只，180-200g，均购自西安交通大学医学院实验动物中心。采用“双套入”法建立金黄地鼠对SD大鼠协调性异种心脏移植模型。将实验动物随机分为6组：对照组(n＝10)，不予任何治疗措施；环孢素组(n=10)，移植当日起每日腹腔注射环孢素10mg/kg；脾切除组(n＝10)，移植心脏复跳后即予以脾切除；D0脾切除＋CsA组(n＝15)，移植心脏复跳后即予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg；D1脾切除＋CsA组(n＝15)，移植术后1d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg；D3脾切除＋CsA组(n=10)，移植术后3d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg。 　　1.2 术后处理与观察 　　每组随机选取5例实验动物观察移植心脏存活时间。移植心脏复跳至停跳的时间为异种移植物存活时间[2]。移植心脏存活时间大于30d认为长期存活。移植物在3d内停跳，视为手术失败。 　　1.3 血清标本与组织标本的采集 　　分别于移植术后1、2、3、7、14、30d剖杀动物取血清、移植心脏标本，将血清标本保存在-20℃低温冰箱中，以备检测血清中补体活性和异种反应性抗体IgG、IgM的滴度。取供体心脏组织进行HE染色的组织病理学检测。 　　1.4 CH50实验检测各实验组血清补体溶血活性 　　配制2%(体积分数)绵羊红细胞悬液。各实验组血清、正常大鼠血清(对照)稀释20倍。用生理盐水将溶血素稀释为2u/mL。在各管中分别加入试剂和反应物，放入37℃水浴箱中温浴30min。选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上，540nm波长条件下，测量读取吸光度A值。每毫升血清总补体活性(单位)＝1/血清用量×稀释倍数。 　　1.5 异种反应性抗体IgG、IgM的测定 　　应用流式细胞技术测定对照组、D1脾切除＋CsA组、D3脾切除＋CsA组大鼠血清中异种反应性IgG、IgM抗体[3]。采用CellQuest软件分析系统进行数据处理。实验动物血清中所含异种反应性IgG、IgM抗体相对滴度应用下列公式表示：异种反应性IgG、IgM抗体相对滴度＝各实验组血清平均荧光强度/正常大鼠血清平均荧光强度。 　　1.6 免疫组化染色检测各实验组移植物组织中异种反应性抗体IgM、IgG的沉积 　　石蜡切片脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温下孵育20min。微波抗原修复，10%(体积分数)山羊血清封闭。滴加一抗，抗体稀释度为1∶50，置冰箱4℃过夜。加聚合物增强剂50-100μL，在3