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不同条件下NK细胞在小鼠黑色素瘤内浸润 　 作者：嵇晶晶，包颖兰，于常华，崔 凤，吕慧芳，徐玉清 【摘要】 目的 比较DC及IL2，IL15维持NK细胞体内活性的作用效果。 方法 DAPI标记的NK细胞输入负瘤小鼠体内，同时分别给予DC、IL2及IL15，不同时间取肿瘤组织，荧光显微镜及电镜观察；MTT法测NK杀伤活性。 结果 DC可增强NK杀伤活性，NK/DC为1∶1时NK细胞杀伤活性强于NK/DC为10∶1时(Ｐlt;0.05)。肿瘤组织内NK分布呈时间及剂量相关性，DC组NK浸润数量多于IL2组及IL15组，但无明显差异(Ｐgt;0.05)。结论 24小时内DC可维持并促进NK细胞活性，无需依赖外源性细胞因子。NK与DC的相互作用与剂量相关。 【关键词】 NK；DC；IL2；IL15；荧光显微镜 NK细胞（natural killer cell，NK）可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,对宿主自身正常细胞无杀伤作用。细胞因子IL2及IL15可调节其杀伤及分泌功能。DC细胞（dendritic cell，DC）是机体内最强的抗原提呈细胞，可表达共刺激分子,分泌细胞因子,诱导初始免疫应答。NK细胞通过直接作用或生物信号间的协同作用活化DC，DC又可促进NK分泌功能，诱导CTL反应[1]，在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。本研究通过比较IL2, IL15及DC与NK细胞的作用效果，寻求NK细胞在肿瘤免疫治疗中发挥最佳效应的适用途径。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料 rhIL2购自北京远策药业有限公司；rmIL15，rmIL4，rmGMCSF购自英国Peprotech EC公司；Dynabeads M450CD8购自美国Dynal Biotech公司；4，6联脒2苯基吲哚DAPI，购自美国Sigma公司。 1.2 动物模型的建立 C57BL/6小鼠，雄性，18～22 g，8～12周龄（购自哈医大二院动物实验中心）。培养小鼠黑色素瘤细胞株B16（购自上海坤肯细胞库），小鼠背部皮下注射。 1.3 NK细胞的体外培养及标记 将C57BL/6小鼠处死，取出脾脏制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加rhIL2至6 000IU/ml，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。第3天加入Dynabeads于4℃共同作用20 min，去除CD8＋细胞 [2]。加入新鲜RPMI1640培养基，隔日给rhIL2。第6、7天加入DAPI 50 mg/ml于恒温培养箱中培养3 h后收集贴壁细胞备用。 1.4 DC的体外培养 将C57BL/6小鼠处死，取四肢骨骨髓制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加入10ng/ml rmGMCSF，10ng/ml rmIL4，于恒温培养箱中培养[3]。隔天半量换液，培养6～8天收集细胞备用。 1.5 MTT法测NK细胞杀伤活性 靶细胞为B16细胞。分四组：①NK细胞对照组；②NK＋IL2（1 000IU/ml）组；③NK＋IL15（10μg/ml）组；④NK＋DC组，NK与DC比分别为10∶1，1∶1，1∶10。效靶比5∶1，10∶1，20∶1，设立效应细胞对照孔（E），靶细胞对照孔（T），反应孔（E+T），每组设三个复孔，测定的OD值取三孔均值，按以下公式计算： NK细胞杀伤活性（％）＝（1―ODE+T -ODEODT）×100％ 1.6 黑色素瘤皮下模型内NK表达的测定 将5×106个DAPI标记的NK细胞通过鼠尾静脉注入负瘤小鼠体内，分别给予不同剂量的IL2,IL15及DC，于6h，12h，24h将鼠处死，取瘤组织，做冰冻切片，荧光显微镜下观察；部分经3%戊二醛固定电镜观察。 1.7 统计学分析 应用SPSS统计软件处理数据，采用t检验。 2 结果 2.1 NK细胞杀伤活性的比较 效靶比为20∶1时实验组NK细胞的杀伤活性均强于对照组。NK∶DC为1∶1时，杀伤活性较10∶1时有显著增强（Ｐlt;0.05），而再加大DC的剂量杀伤率未见增强。NK∶DC为1∶1时NK杀伤活性较IL2组及IL15组有所提高，但无统计学意义（Ｐgt;0.05），见表1。表1 NK细胞杀伤活性的比较 　 2.2 电镜观察结果 镜下肿瘤细胞周围可见NK细胞和DC细胞，见图1。DC表面有较多树突状突起，胞质内有溶酶体颗粒，细胞器较少，胞核形状不规则。NK表面有少量指状突起，胞质较多，细胞核呈卵圆形，核内染色质丰富，异染色质多分布在边缘。肿瘤细胞体积较大，约30～40μm，细胞表面可见密集分布的微绒毛，胞质内有较多的线粒体。图1可见DC的伪足正伸入瘤细胞体内，DC突起与瘤细胞质膜融合。靶