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外源性人aFGF在内皮祖细胞中分泌 　 作者：颜雪芸, 王飞, 周卿, 荣烨之, 陈书艳 毕业论文 【关键词】; 酸性成纤维细胞生长因子;,信号肽;,转基因 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 观察外源重组分泌型人酸性成纤维细胞生长因子（spaFGF）在内皮祖细胞（EPC）中的分泌。方法: 以腺相关病毒为载体, 将spaFGF基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）分别导入内皮祖细胞中。收集转基因EPC和未转基因EPC培养液, 用ELISA方法检测其中的aFGF蛋白, 并比较3组细胞分泌的aFGF的量。结果: 在感染细胞的第4天, 转基因EPC出现绿色荧光。spaFGFEPC组分泌的aFGF量显著高于GFPEPC和EPC组[（862±49） ng/L vs （115±16） ng/L, Plt;005; （862±49） ng/L vs （98±10） ng/L, Plt;005）]。结论: 在EPC中导入外源性spaFGF基因能增强人aFGF的分泌。 毕业论文 　　[关键词]; 酸性成纤维细胞生长因子; 信号肽; 转基因 ; 　　通过基因修饰的方法促进治疗性血管新生是近年来心血管领域的一个新的研究热点, 代表着一种克服缺血组织再灌注障碍和促进侧枝发展的新方向[1]。酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor, aFGF, FGF1）是FGF家族的重要成员, 在血管形成过程中有重要作用[2], 可以通过促进受损内皮细胞修复等机制, 促进血管再生。由于原始aFGF缺乏信号肽, 不能由完整细胞分泌, 故直接用aFGF进行基因转染, 治疗效果不理想。本实验中, 我们将一个带有信号肽序列的重组人aFGF基因（spaFGF）克隆到AAV载体中, 以病毒转染细胞的方式, 将spaFGF基因导入EPC中。通过基因表达, aFGF得以由EPC分泌, 为下一步研究转基因细胞移植促进缺血组织的血管新生奠定基础。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; spaFGFpAAVIREShrGFP质粒为本实验室构建; pAAVIREShrGFP质粒、 pAAVRC质粒和pHelper质粒购自Stratagene公司; AAV293细胞, AAVHT1080细胞由发育生物学实验室惠赠; EPC为本实验室自备; 高糖DMEM培养液和胰蛋白酶EDTA购自Gibco公司; aFGF ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。 毕业论文 　　1.2; 方法 毕业论文 　　1.2.1; 构建含外源基因的重组AAV; 我们先前已构建含信号序列的分泌型人aFGF基因[3], 并将此重组基因插入到AAV载体质粒pAAVIREShrGFP上。携带spaFGF的重组pAAVIREShGrFP质粒与pHelper质粒、 pAAVRC质粒共转染AAV293细胞后, 可包装出编码spaFGF基因的重组病毒spaFGFAAV; 用同样的方法包装出编码绿色荧光蛋白的重组病毒GFPAAV。 毕业论文 　　1.2.2; AAV感染HT1080细胞; 将AAVHT1080细胞以3×105/孔的密度接种在6孔板中, 每孔加入2 mL含100 mL/L FCS的DMEM培养液, 37℃、 50 mL/L CO2, 培养24 h。吸出6孔板中培养液, 按1 mL/孔将倍比稀释的病毒液加到6孔板中, 细胞在37℃培养1 h后, 每孔加入1 mL含100 mL/L FCS的DMEM。继续培养。 毕业论文 　　1.2.3; AAV感染内皮祖细胞; 将EPC分成3组, 按1×105个/孔接种到6孔板中。分别用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC, 未感染的EPC作为对照, 标记为spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC。培养液为含50 mL/L胎牛血清的EGM2, 在37℃、 50 mL/L CO2中培养24 h。用PBS液洗涤细胞3次, 彻底洗去血清成分。在试管中将200 μL AAV浓缩液与1 mL无血清的EBM2混合, 加入到每孔细胞中。分别标记为“EPCspaFGF”, “EPChrGFP”和“EPC”。将细胞置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h, 期间每隔15 min转动1次培养板, 保证病毒液与细胞充分接触。2 h后用1 mL含50 mL/L胎牛血清的EGM2代替无血清的EBM2, 置于细胞培养箱中继续培养。 毕业论文 　　1.2.4; 检测细胞分泌的aFGF蛋白; 收集spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC 3组细胞培养液, 离心后, 取上清液, 用ELISA试剂盒检测其中的人aFGF蛋白。取样品与倍比稀释的标准品各01 mL加入已包被抗人a