系统性红斑狼疮患者外周血T、B淋巴细胞亚群基因表达谱探究.doc

系统性红斑狼疮患者外周血T、B淋巴细胞亚群基因表达谱探究 　摘　要：寻找与SLE有关的致病基因。方法：应用基因芯片技术，获得SLE患者外周血T、B淋巴细胞亚群的基因表达谱，在差异表达显著的基因中挑选4个位于SLE易感区段的基因，通过TaqMan实时PCR技术在55例SLE患者中验证基因的差异表达。结果：确定Bcl-2、KLRC1、EGR-1及IL-4R基因为SLE易感基因的候选基因；实时PCR结果表明，在SLE患者外周血T细胞亚群中，Bcl-2基因及IL-10基因ΔCt值显著低于健康人对照（P＜0.01），EGR1基因和IL4R基因的ΔCt值显著高于健康人对照（P＜0.01）。在SLE患者外周血B淋巴细胞亚群中，由于B细胞淋巴亚群所占淋巴细胞比率过低，基因检测数据不稳定，故未作统计学分析。结论：Bcl-2、KLRC1、EGR-1及IL-4R与SLE的发病存在密切关系。 关键词：系统性红斑狼疮；候选基因；基因表达谱；荧光实时定量PCR 系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）是一种涉及到多器官的自身免疫性疾病，尽管人们已对SLE发生的分子机制进行了一些研究，但目前仍不清楚[1]。因此筛选与SLE相关的致病基因，不仅有助于阐明SLE的分子发生机制，而且更有利于SLE的诊断和治疗。近年来，基因芯片技术能从基因组范围上进行基因表达的筛选和鉴定。Magdalene等对SLE患者骨髓细胞的基因芯片研究分析显示，SLE易感基闪能够通过改变细胞凋亡、信号传导影响淋巴细胞和粒细胞的凋亡，参与SLE的发病和病程发展[2]。因此，本文首次利用基因芯片技术对10例SLE患者外周血T、B淋巴细胞基因表达谱进行研究，并且通过荧光实时PCR在55例SLE患者中验证，探讨了在SLE发病过程中可能的因素，以便为深入研究B淋巴细胞参与SLE的分子机制提供资料及为SLE治疗提供新的靶点和治疗途径。现报告如下。 　1 资料与方法 　1.1 一般资料：诊断均符合1982年美国风湿病学会（ACR）修正的SLE诊断标准的原发性系统性红斑狼疮患者10例用于基因芯片研究，均为初次发病，未用药。男2例，女8例，活动指数均大于8，平均年龄31.2岁，正常对照健康女9例，男1例，平均年龄28.5岁。按照1982年美国风湿病学会（ACR）修订的系统性红斑狼疮诊断标准，从本院风湿科门诊患者中随机抽取55例SLE患者用于实时PCR研究，其中34例患者处于活动期（SLEDA I≥8），平均年龄40.8岁，21例患者处于相对静止期（SLEDAI＜8），平均年龄34.9岁，健康人对照30例，均来自本院体检健康人群，平均年龄39.7岁。 　1.2 试剂：TRIzolReagent（LifeTechnologies，Inc），Ambion messageAmp aRNA kit（Ambion，Inc），CyScribe cDNA labeling kit （Amersham Pharmacia Biotech，Ltd），QIAgene RNeasy mini kit （QIAGEN，Inc），QIAgene PCR Purification kit（QIAGEN，Inc），FTC2000实时荧光定量基因扩增仪（加拿大枫岭公司），CD3+、CD19+免疫磁珠（Dynal，inc），8806点基因芯片购自深圳微芯生物有限公司。 　1.3 实验方法 　1.3.1 T、B淋巴细胞亚群的基因表达谱的取得。 　1.3.1.1 T、B淋巴细胞亚群的分离：取健康对照组及10例系统性红斑狼疮患者外周血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，应用CD3+、CD19+免疫磁珠分离T、B淋巴细胞亚群，用于T、B淋巴细胞亚群基因芯片研究。 　1.3.1.2 用Trizol Regent提取总RNA的提取，电泳检测RNA的完整性与纯度。 　1.3.1.3 标记的cRNA探针与基因表达芯片杂交及检测：根据试剂盒操作说明进行。 　1.3.1.4 基因芯片的图像扫描：用Scan Array4000进行图像扫描。 　1.3.1.5 数据分析：首先使用QuantArray4000软件将扫描的图像信息转化为数据，并进行标准化，进一步将得到的原始数据使GeneSpring Microarray Analysis Software（Silicon Genetics）进行表达差异和聚类分析等。 　1.3.2 实时荧光定量PCR筛选、鉴定差异表达基因 　1.3.2.1 cDNA的准备：提取55例患者及正常对照外周血及T、B淋巴细胞亚群总RNA，以其中的mRNA作为模板，应用Revert Aid? First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI），采用Olig