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维生素D减缓牙周炎症反应实验探究 　　维生素D(vitamin D )为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2(麦角钙化醇)和VD3(胆钙化醇)。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。维生素D是一种脂溶性维生素，有五种化合物，对健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3。它们有以下三点特性：它存在于部分天然食物中;人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素D3。适当的日光浴足以满足人体对维生素D的需要。 　　摘要：目的：初步探讨维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞炎症反应的抑制作用，为牙周病的防治提供一定的依据。方法：采用酶联免疫吸附实验、实时荧光定量核酸扩增检测系统检测维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1beta;、肿瘤坏死因子alpha;水平的影响。结果：维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1beta;、肿瘤坏死因子alpha;有显著的抑制作用，最低有效浓度为6.25mu;g/ml，且随着维生素D浓度的增加，抑制作用越明显。结论：维生素D是一种潜在的防治牙周炎症反应的药物。 　　关键词：维生素D;1，25-二羟维生素D3;牙周炎;肿瘤坏死因子alpha;;白介素1beta; 　　牙周炎是以炎症因子渗出、牙周支持组织破环为主要病理表现的慢性、广泛性炎症反应，是成人失牙的首要原因。已被医学界定论为继癌症、心脑血管疾病之后，威胁人类身体健康的第三大杀手，也是口腔健康的“头号杀手”。流行病学研究结果显示牙周炎是加重心血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多种系统性疾病进程，影响预后的重要诱因[1]。发病机制与免疫、炎症反应密切相关。现已证实革兰氏阴性厌氧菌――牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎发生、发展的主要病原菌，约占牙周炎患者95%以上的病变活动区域[2]。牙龈卟啉单胞菌能利用多种毒力因子如半胱氨酸蛋白酶(常指牙龈素)、菌毛和脂多糖侵袭牙周组织和宿主免疫系统。维生素D是保持骨骼健康，调节机体免疫、炎症反应的重要元素，不仅与钙吸收、破骨细胞活性密切相关，还参与调节基因表达、蛋白合成和免疫/炎症反应[3]。本实验的目的就是研究维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞炎症反应的影响。 　　一、材料和方法 　　1.1 材料 　　维生素D代谢物1，25-二羟维生素D3[1，25(OH)2D3]购自Sigma公司，牙龈卟啉单胞菌购自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。1，25-二羟维生素D3溶液的配置：将晶体用95%的乙醇配置成10mg/ml的母液，置于-20℃冰箱中储存备用。使用时用细胞培养液稀释成各种浓度梯度(100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625mu;g/ml)的工作液。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验菌液的准备、细菌复苏及培养：将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌株复苏并接种于含有20mu;M氯高铁血红素和0.0001%维生素K的Todd-Hewitt肉汤(THB-HK)中，在37℃厌氧环境下(CO2 10%、N2 90%)培养48h，经形态学鉴定后传代培养24h，备用。 　　1.2.2 人牙周膜成纤维细胞的培养：采取酶消化原代培养法。刮取临床因正畸或阻生拔除牙齿的根中1/3的健康牙周膜，立即投入含三抗的D-Hanks内。清洗刮取的牙周膜，去除血污及不需要组织。加入0.1%胶原酶37℃消化30min，加入含10%FBS的DMEM终止消化，二层无菌纱布滤除组织块，1 000ppr 5min离心去上清，加入含10%FBS的DMEM进行培养。4～8代用于实验。 　　1.2.3 维生素D对人牙周膜成纤维细胞活性的影响：消化离心收集人牙周膜细胞，台盼蓝计数调整细胞密度为106/ml接种于96孔板中，培养2h待细胞贴壁后添加不同浓度的维生素D和厌氧培养了24h的牙龈卟啉单胞菌的菌液，继续孵育72h。接着每孔添加10mu;l MTT溶液置于细胞培养箱中培养4h，再每孔添加100mu;l溶解溶液孵育过夜。最后使用分光光度仪进行读数。 　　1.2.4 牙龈卟啉单胞菌诱导人牙周膜成纤维细胞发生炎症反应：消化离心收集人牙周膜细胞，台盼蓝计数调整细胞密度为106/ml接种于24孔板中，培养过夜。次日，在孔板中添加200mu;l不同浓度的维生素D置于培养箱中继续培养2h。将厌氧培养了24h的牙龈卟啉单胞菌的菌液转移至塑料离心管，10 000ppr，10min，4℃离心，弃上清液后用含1%FBS的DMEM清洗2次。测 OD660，并根据孔板内牙周膜细胞密度计算感染倍数(multiplicity of infe