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脱镁叶绿酸制备及其光敏抗菌活性 　 作者：唐蕾 徐磊 韩跃 毛洪 【摘要】 以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果，对革兰阴性菌和酵母无明显作用。 【关键词】 脱镁叶绿酸； 叶绿素酶； 高效液相色谱； 光敏抗菌活性 ABSTRACT Partially purified chlorophyll was used to prepare pheophorbide (Pheide) by chlorophyllase hydrolysis and selective acidic hydrolysis methods. High performance liquid chromatography analysis showed that the Pheide A was obtained with higher purity by acidic hydrolysis method. The antimicrobial test showed that Pheide had obvious photosensitive activity against Gram positive bacteria. KEY WORDS Pheophorbide; Chlorophyllase; High performance liquid chromatography; Photosensitive antimicrobial activity 光敏剂是一些具有光活性的化合物，可以选择性地富集在特定的组织，在紫外或可见光的激发下，产生光动力杀伤作用，起到杀菌和治疗肿瘤的功效。近年来，由于抗生素的滥用所引起的毒副作用、耐药菌的出现和自然微生物群落的破坏，使得天然、环境友好、能够有效地杀灭有害菌而不伤及邻近组织的光敏剂颇受关注［1］。脱镁叶绿酸(Pheide)作为卟啉类光敏活性剂具有结构明确、稳定，在红外区有较强的吸收，光敏活性更有效等特点，在癌症的光敏动力学治疗中已有报道［2～4］，但其光敏杀菌作用尚待探讨。此外，脱镁叶绿酸作为叶绿素(Chl)的中间降解产物在植物中很少积累，分离困难，但可以通过叶绿素的酶促水解和酸降解法获得［5，6］。基于上述分析，本文对酶法和酸法叶绿素降解产物进行了比较，并研究了其对细菌和酵母的光敏活性。 1 材料与方法 1.1 菌种 酵母 八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octosporus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黏红酵母(Rhodotorula glutins)、隐球酵母(Cryptococcus sp.)。 细菌 产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)、金葡菌(Staphylococcus aureus)、四联球菌(Micrococcus tetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcus albus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)。均为实验室保藏菌种。 1.2 培养基及培养条件 酵母培养基 酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000ml，pH6.0。 细菌培养基 NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000ml，pH7.0。121℃灭菌20min。 培养温度 酵母28℃，细菌37℃，光照为培养箱内置光源。 1.3 抗菌实验 (1)在固体平板上均匀涂布200μl菌液，取10μl待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂培养基表面，光照条件下恒温培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药物(细菌为氨苄西林，酵母为放线菌酮)相比较，每个处理设3个重复。 (2)将待测菌在含有50μg/ml的Pheide培养基上十字划线，比较光、暗条件对微生物生长的影响，每个处理设3个重复。 1.4 叶绿素的提取 参照Iriyama法［7］，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和663nm处的吸光值，按照Arnon公式计算叶绿素含量： Chl A(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645 Chl B(mg/ml)=0.0229A645-0.00468A663 1.5 脱镁叶绿酸的制备 (1)酶解法 采集新鲜的豌豆叶