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艾灸对衰老模型鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度影响实验探究 　【摘要】 目的：探讨艾灸“足三里”延缓衰老的机理。方法：对臭氧衰老模型小鼠“足三里”穴实施艾灸治疗后，用彗星实验(Comet Assay)检测小鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤程度。结果：艾灸小鼠外周血淋巴细胞DNA的拖尾率显著下降(P＜0.05)，尾长显著减短(P＜0.05)，差异有统计学意义。结论：艾灸能够通过提高机体自身抗自由基氧化损伤的能力，减轻淋巴细胞DNA的损伤程度，从而达到延缓衰老的目的。 【关键词】 艾灸 衰老 淋巴细胞 DNA氧化损伤 小鼠 足三里 在衰老的研究中发现，随增龄DNA存在着不同程度的各种损伤及损伤的积累现象［1、2］。而在生物体内，导致DNA损伤的物质，主要是生物新陈代谢过程中广泛存在的自由基。其诱导过度的氧化还原反应，长期随机毒害的结果，是引起生物衰老的原因之一［３］。免疫系统的功能下降是衰老的主要特征之一，针灸可有效提高机本免疫器官内抗氧化酶的活性，减轻脂质过氧化程度［4］，但与此同时，能否起到对免疫细胞内DNA的保护作用，目前涉足不多。本研究利用彗星实验观察艾灸“足三里”对臭氧(O3)衰老模型鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度的影响，从而探讨艾灸延缓衰老的可能机理。 1 材料与方法 1.1 实验动物、主要药物试剂及器材 健康3月龄昆明种雄性小白鼠40只(四川大学实验动物中心提供)，体重25～30g。维生素E(厦门鱼肝油厂)，正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖(PROMEGA分装)，溴化乙啶、肌氨酸钠、二甲基亚砜(SIGMA生产)，Tritox100(BIB生产)，木质臭氧发生柜，DYYⅢ型水平式电泳仪(北京六一仪器厂)，荧光显微镜(Nikon)等。 1.2 动物实验方法 1.2.1 动物的分组及造模 40只小鼠随机分为空白组、模型组、模型+艾灸组和模型＋维生素E组放入臭氧发生柜(O3浓度为1.9mg/m3)，连续造模56d，每天24h。将空白组同时放入与臭氧发生柜相同大小但无O3的柜内，均按相同标准饲养。 1.2.2 治疗方法 1.2.2.1 模型加艾灸治疗组 于造模前5d起，将小鼠仰卧位固定，根据《实验针灸学》定位，用特制清艾条分别灸治双侧“足三里”穴，距穴位皮肤0.5～1.5cm左右，每次每穴灸15min，隔日1次。共治疗62d。 1.2.2.2 模型加维生素E对照组 造模前5d起，按人鼠剂量换算，将维生素E用蒸馏水配成均匀悬浊液，按每日250mg/kg灌胃给药，共治疗62d。空白组和模型组要求隔日抓拿1次以外，未予任何治疗和处理。 1.3 指标检测方法 1.3.1 样本采集 动物造模及治疗结束后禁食12h，次日小鼠股动脉取血1ml，抗凝处理。 1.3.2 淋巴细胞DNA损伤检测 将1ml抗凝血，用2ml的PBS稀释混匀，轻轻加入已盛有1.5ml淋巴细胞分离液的离心管液面上，室温下1000r/min离心10min。弃掉上清液，吸取中间有核细胞层，移入离心管中，以PBS清洗1次，再次离心收集淋巴细胞，调整细胞数至1×07个/ml，同时，用台盼蓝法检测活细胞百分率在95%以上后，采用彗星实验进行［5、6］淋巴细胞DNA损伤的检测。实验每张片子各观察150个细胞，记录拖尾细胞数，计算拖尾率；并用目镜测微尺每张片子随机测量50个细胞的尾长，计算平均尾长。 1.4 资料处理 对检测结果采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，结果均以±s表示。 2 结果 见表1表1 艾灸治疗对小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度比较与艾灸组比较ΔP＜0.05 　　　3 讨论 一切生物的天然寿限都是由遗传物质DNA上的基因安排的，但生物的遗传物质是受后天环境及其它内外因素影响的［7］。在影响生物寿限的各种后天因素之中，DNA氧化损伤已公认为是最重要的致衰老因素之一［3］。所以，现代中医研究认为［8］:DNA作为生命活动的基本物质及遗传信息的载体与中医的肾精有直接联系，并随衰老而发生损伤变化。 损伤的DNA随时间的推移，并不能完全被修复，损伤呈累积增多趋势。实验证明［2］:老年大鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤情况较青年和中年大鼠严重，老年大鼠的彗星样淋巴细胞出现率较青年、中年大鼠明显增多，中年大鼠也显著高于青年大鼠；老年大鼠外周血淋巴细胞电泳后的总彗星长度较中年和青年大鼠明显增加;这表明DNA损伤随年龄的增长而损伤程度呈加重的显著趋势。 艾灸“足三里”延缓衰老是历来常用方法之一，研究与记载颇多。足三里穴有补益后天，培元固本的作用；艾灸有温经通络、行气活血的作用。此次研究结果表示，与抗自由基氧化剂维生素E的作用类似，艾灸“足三里”穴能够降低衰老模型鼠外周血淋巴细胞DNA的拖尾率，减短细胞DNA的拖尾尾长，从而减轻了淋巴细胞DNA的损