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花椒抗宫颈癌Caski细胞作用及其机制初步探究 　 作者：袁太宁，肖长义，汪鋆植 【摘要】 　　目的研究花椒挥发油抗宫颈癌Caski细胞作用及其可能的机制。方法花椒挥发油按不同时间（24, 48, 72 h）及不同浓度(0. 5～8 mg/ml)分别处理Caski细胞，MTS法分析细胞的增殖速度，用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期。结果4 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72h可显著地抑制Caski细胞增殖，1 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现，且G0/G1期细胞增多, S期和G2/M期细胞减少。 结论花椒挥发油可抑制Caski细胞增殖并诱导细胞凋亡。 【关键词】 花椒 Caski细胞 细胞凋亡 　　花椒不仅是深受民众喜爱的重要食用性香料，还是常用的中药材，其资源在我国分布很广，具有很高的安全性。花椒挥发油是花椒主要成分之一,其含量为1%～6%(产地不同含量也不同)。油中主要成分为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。国内外研究报道花椒对镇痛、镇静、抗炎、杀菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化等均具有较强的药理学活性［1～4］。随着对花椒提纯和药理作用的深入研究,发现花椒还具有抗肿瘤作用，但目前对花椒抗肿瘤的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了。为了认识花椒抗癌作用的机制和特点，我们选用宫颈癌Caski细胞为研究对象，观察了花椒对该细胞的抑制作用，以期探讨花椒抗肿瘤作用及其可能的机制。 　　1 材料与仪器 　　花椒，采于湖北省宜都县，经汪鋆植博士鉴定为Zanthoxylum bungeanum。Caski细胞由三峡大学分子生物学研究所提供；MTS细胞增殖分析试剂由Promega公司提供；其他化学试剂来自Sigma公司和华美公司；EPL CSXL流式细胞分析仪为Becman Coulter公司产品；全波长酶标仪为为Thermo公司产品；R206D旋转蒸发器为上海申生科技有限公司产品；超声破碎仪为北京君合华科技发展有限公司产品。 　　2 方法 　　2.1 花椒挥发油制备使用旋转蒸发器提取花椒挥发油并过滤除菌，称取适量挥发油加入5%Tween-80水溶液中，超声破碎仪处理10min，用RMPI 1640无血清培养基倍比稀释成8，4，2，1，0.5 mg/ml的浓度。 　　2.2 Caski细胞培养Caski细胞接种于含10%小牛血清的RMPI 1640培养液,青霉素100 μg/ml,链霉素100 μg/ml。置于37℃，5% CO2培养箱中常规培养。 　　2.3 细胞增殖分析将对数生长期的Caski细胞以4×107/L；细胞数接种于圆底96孔培养板,每孔50 μl。37℃培养24h后,向孔内直接加入含不同浓度花椒挥发油的RPMI 1640培养基50 μl。在加入药物后选定的时间点(24，48，72 h),向每孔中加入20 μl MTS试剂,37℃继续保温2 h显色,于490 nm波长下读取OD值。 　　细胞生存率（%）=OD药物/OD对照×100%； 　　细胞生长抑制率（%）=(100-细胞生存率)×100% 　　2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期取1×106对照细胞或经花椒挥发油处理的细胞,用冰冷PBS洗涤1次后,再悬浮于500 μl低渗DNA染色液中(1 g/L Sodium Citrate, 0.1%TritonX 100, 100 mg/L RNase, 50 mg/L Propidium Iodode), 4℃保温30min后,经流式细胞仪分析凋亡细胞及细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。 　　PI（%）=（S+G2/M）/(G1+S+G2/M)×100% 　　2.5 统计学处理　数据用±s表示，采用组间t检验进行统计分析。 　　3 结果 　　3.1 花椒挥发油抑制Caski细胞的增殖花椒挥发油对Caski细胞增殖呈明显抑制作用，且这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加（见图1）。花椒挥发油浓度为4 mg/ml时，24 h抑制率为20%, 48 h抑制率为46%, 72 h抑制率为78%。 　　　3.2 花椒挥发油诱导Caski细胞的程序性凋亡因发生凋亡的细胞核内,部分DNA发生片段化降解而丢失,经Propidium Iodode染色后, 这部分细胞核将出现在G1峰之前,即亚凋亡峰的位置。1 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现。所以花椒挥发油可诱导Caski细胞的程序性凋亡。 　　3.3 花椒挥发油抑制Caski细胞周期的正常转换1 mg/ml花椒挥发油作用72 h后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性（见图2），显示花椒挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换,使细