芽孢杆菌外毒素保护性抗原及上游强启动子穿梭载体构建.doc

芽孢杆菌外毒素保护性抗原及上游强启动子穿梭载体构建 　关键词：炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因 　　摘要:目的构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的两种穿梭载体与上游强启动子。方法将解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子克隆到载体pbluescript-sk（+）上，构建载体pBLKSP;以A16R疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株）DNA为模板，设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原（PA）的全基因，先克隆到载体pBLKSP，再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体。结果酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了带有强启动子的两种穿梭载体。为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。 　　关键词:炭疽芽孢杆菌;穿梭载体;重组;基因 　　Constructionofshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter. 　　　 　　Abstract:ObjectiveToconstructtwoshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter.Meth-odsThepromoterregionoftheα-amylasegeneofBacillusamyloliquefacienswasclonedintopbluescript-sk（+）vector;thean-thraxtoxinprotectiveantigenwholegenewasamplifiedbynestedPCRfromA16vaccinestraintemplate.FirstlyitwasclonedintopBLKSPvector，thenrecombinatedwithPUB110vectortoformtwokindsofshuttlevectors.ResultsRestrictionanalysisandDNAsequencingconfirmedthattheclonedgenefragmentsencodedanthraxtoxinprotectiveantigen.ConclusionTwokindsofshuttlevectorshavebeensuccessfullyconstructed.ithassetfoundationforfurtherstudyonthehighlyeffectiveexpressioninnontoxican-thracisstrainandmoleculevaccineresearchofBacillusanthracis. 　　Keywords:Bacillusanthracis;Shuttlevector;Recombination;Gene 　　炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）引起的一种兽源性人畜共患的急性传染病，主要通过皮肤接触、呼吸道、消化道等多种方式感染，其死亡率极高。因此，开展炭疽疫苗等预防性研究在我国还是尤为重要。炭疽芽孢杆菌含有两种能够独立复制的质粒pXO2和pXO1，分别编码细菌荚膜和炭疽毒素［1］。质粒pXO1编码3种毒素:保护性抗原（Protectiveanti-gen，PA）、致死因子（Lethalfactor，LF）和水肿因子（Edemafac-tor，EF）［2，3］。保护性抗原PA介导EF/LF进入细胞内发挥毒性作用但本身并不具有任何毒性，是一种很有效的保护性抗原和免疫原，而且是获FDA批准的人用炭疽疫苗AVA的主要免疫活性成分。本实验克隆和表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）全长基因，以能在芽孢杆菌中自主复制并有穿梭功能的载体PUB110为基础，构建了具有强启动子双筛选功能的两种大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体pJB1和pJB2，为进一步其在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和能否作为预防炭疽芽孢杆菌感染的分子疫苗打下了基础。 　　1材料和方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1菌株与质粒A16R疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株），无毒炭疽疫苗株（pXO1-pXO2-型ΔSterne-1株）由卫生部兰州生物制品研究所惠赠;质粒Pbluescript-sk（+）由上海生工惠赠;穿梭质粒PUB110邮购自美国ATCC细胞库;GM2163（Dam-Dcm-）由NEB北京总代理公司赠送;HB101感受态细胞购于北京经科宏达有限公司。 　　1.1.2酶及主要试剂TakaRaLATag酶，TakaRaT4DNA连接酶，购自北京六合通生物技术有限公司;TOP