苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白亲及力探究.docVIP

苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白亲及力探究 　 　　 论文 关键词 青霉素结合蛋白苯唑西林 亲和力 　　论文摘要 利用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光放射自显影术及竞争分析法检测苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白的亲和力。结果发现金葡球菌有5条青霉素结合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范围41~87kD。苯唑西林主要与金葡球菌ATCC25923的PBP1和PBP2亲和力强,尤其是与PBP2亲和力很强。由此说明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。 论文代写 　　青霉素结合蛋白(penicillin-bindingprotEins,PBPs)是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他β-内酰胺类抗生素螯合的细菌蛋白质,即是抗生素作用的靶位点,抗生素与这些靶位点结合后,干扰细菌细胞壁肽聚糖合成而导致细菌细胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)对金葡球菌具有强大的抗菌作用,对其作用机制的研究,国内未见报道。本文应用微生物生化研究方法,从金葡球菌标准株ATCC25923中提取细菌内膜蛋白,采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、荧光放射自显影术及竞争分析法,研究了苯唑西林与金葡球菌标准株ATCC25923细胞内膜青霉素结合蛋白的亲和力,探讨苯唑西林杀菌作用的分子学基础。 　　1 材料和方法 论文代写 　　1.1 药品及试剂 论文代写 　　苯唑西林为国家暂行标准品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)为Sigma公司产品; -青霉素G钾,比活性 Bq/mmol,英国Amersham同位素公司产品;十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 为Sigma公司产品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司产品;二甲基亚砜(DMSO),重庆化学试剂厂产品;X光片为美国Kodak公司产品。 　　1.2 实验仪器 　　超声粉碎机(Virsonic 300型),美国Vir-tis公司产品;超速低温离心机Beckman L8-60,美国Beckman公司产品;直立式电泳仪,北京六一仪器厂生产;凝胶吸干器(gel slabdryer),英国Bio-Rad公司产品。 毕业论文 　　1.3 菌株 论文代写 　　金葡球菌标准株ATCC25923,获自 中国 科学 院菌种保存中心。 论文代写 　　1.4 研究方法 　　1.4.1 增菌 论文代写 　　将金葡球菌接种于M-H肉汤(pH7.2)25ml中,37℃恒温振荡(速度150~200r/min)孵育16h,再转移至250ml新鲜预热的M-H肉汤中继续振荡4h。于10℃,8000×g离心10min收集菌体,用50mmol/L PBS(pH7.0)洗涤1次,称湿菌量可达1~2g。 　　1.4.2 细菌细胞内膜蛋白质的制备 毕业论文 　　参照 文献 [1]并作改进。将湿菌悬于2倍体积的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5,含10mmol/L MgCl2、0.14mol/Lβ-巯基乙醇、0.5mg/L DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中进行超声粉碎(60s破碎+60s间隔,强度14kHz,共6次),在显微镜下观察细胞破裂情况。7000×g,4℃,离心10min去除未破碎细胞。上清液于100000×g,4℃,离心50min使细胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(pH7.0,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巯基乙醇)混匀,放0℃30min,于45000×g,4℃,离心35min,上清液(含细菌内膜蛋白)采用Lowry法[2]测定其蛋白质含量,调节蛋白质浓度为10g/L,分装后放-70℃备用。 毕业论文 　　1.4.3 苯唑西林与 -青霉素G竞争性结合 毕业论文 　　参照文献[3]并有改进。在一系列新鲜配制的苯唑西林溶液(0,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,32,128mg/L)10μl/管中加入膜蛋白20μl(200μg蛋白质)混匀,37℃,孵育10min,然后加入10μl(3.7×104Bq)14C-青霉素G钾继续育10min,最后加入10μl终止缓冲液(3.8%Tris,10%SDS,0.005%溴酚蓝,50%甘油(V/V),25%β-巯基乙醇(V/V),pH7.0)终止反应,煮沸5min,待冷却后作短暂离心,经电泳分离蛋白质。 　　1.4.4 SDS—PAGE 　　使用不连续