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蒲公英总DNA提取及其RAPD-PCR反应条件优化 　 作者：李喜凤 ，杜云锋，张红梅，郝哲，许闽，白雁 【摘要】 目的建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选。结果建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系。25 μl反应体系中含有：1×Taq Mix buffer，50 ng DNA模板，0.4 μmol/L 引物，1.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25U Taq酶。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，38℃复性1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，4℃保存。结论这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。 【关键词】 蒲公英； 基因组DNA提取； 随机扩增多态性DNA技术 　蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.，碱地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag.或同属数种植物的干燥全草，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效，主要用于乳痈、肺痈、肠痈、痄腮、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛等症［1］。蒲公英品种繁多，资源丰富且来源复杂，目前对其鉴别一直沿用经典的性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。而这些方法的鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，在生物学上为物种的遗传表现型，受到遗传因素、生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等影响，具有很大的变异性，存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。 　　随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）技术是由美国杜邦公司的科学家Williams JGK和加利福尼亚生物研究所Welsh J领导的两个研究小组在1990 年同时推出的，该技术根据PCR 原理，以随机设计的寡核苷酸引物扩增DNA中的一些片段。短短几年，此方法已成功地应用于遗传多样性检测［2］、基因定位、品系鉴定［3］、遗传图谱构建和系统学研究等诸多领域。但RAPD扩增易受多种因素的影响，如模板DNA浓度、引物浓度及Taq酶浓度等，扩增条件的变化会对RAPD图谱产生较大的影响，从而影响RAPD分析的准确性和稳定性，因此为了获得重复性和可靠性高的RAPD图谱，对蒲公英进行PCR扩增条件的优化和引物退火温度的确定十分必要。本研究探讨了蒲公英RAPD-PCR反应的优化条件，以期建立可用于蒲公英RAPD-PCR分析的最佳反应体系和扩增程序，为深入开展蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定基础。 　　1 材料与仪器 　　1.1 材料 　　蒲公英叶片于2009-04采自河南中牟、邙山、济源、开封等地，经本院生药学科董诚明教授鉴定为菊科植物蒲公英，用变色硅胶将其叶片快速干燥后置于-20℃冰箱备用。 　　1.2 试剂CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)：上海山浦化工有限公司；Tris(三羟甲基氨基甲烷)：美国Sigma公司；EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)：美国Amresco公司； DL 15 000 bp、DL 2 000 bp DNA Marker：大连TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix：北京TIANGEN公司；10 mer随机引物：上海英骏生物技术有限公司合成；其余化学试剂均为国产分析纯。 　　1.3 仪器 　　DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂； Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析仪：美国BIO-RAD公司；梯度PCR仪：德国Biometra公司；GR22G型高速低温离心机：日本日立公司；微量移液器：德国eppendorf公司。 　　2 方法 　　2.1 蒲公英叶基因组总DNA的提取和检测 在经典的CTAB法的基础上加以改良：称取0.5 g样品加入10%的PVP一起在冰上用玻璃砂在研钵中研磨，磨碎后转移至10 ml离心管中，加入10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液(250 mmol/L氯化钠，250 mmol/L Tris-HCl pH=8.0,50 mmol/L EDTA pH=8.0，5%PVP)，冰浴10 min，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，再用洗涤缓冲液洗涤沉淀1次。加入1 ml 2×CTAB提取缓冲液(100 mmol/l Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA pH=8.0，1.4 mol/L氯化钠，2%CTAB，5%PVP)，100 μl β-巯基乙醇，65 ℃温育3 h，不时振摇。4 ℃12 000 r/min离