第一实验：以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能 bb.docVIP

第一实验：以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能（VIGS）　　　 目的　　 掌握一种分析植物基因功能的方法　　 原理　　　 在病毒载体中插入某一外源基因，然后侵染宿主可引起宿主体内相应基因或序列相似基因的沉默。病毒侵染宿主后导致的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）这一流程如图1-1。其中修饰后的烟草脆裂病毒（TRV）的载体克服了其他病毒载体所固有的缺点。它便于非病毒序列的插入和随后对植物的侵染、介导VIGS缺乏病毒侵染后产生的症状或产生非常轻的症状、侵染的面积比较大、导致的VIGS维持的时间比较长。特别是它能在植物生长点产生基因沉默，锁定宿主的RNAs，然后可通过比较基因沉默后植物的表型等方法来分析基因的功能。TRV可以侵染12属的60多种植物，如烟草、番茄、马铃薯等。以上这些特点使TRV载体在发现植物基因和分析基因功能方面得到广泛的应用。　　　 　　 图1-1 病毒引起的植物基因沉默　　　 　　 　 图1-2 TRV载体　 A：野生型TRV RNA1的结构及位于植物双元转化系统质粒p TRV1中的cDNA克隆；B：野生型TRV RNA2结构及位于植物双元转化载体系统质粒pTRV2中的TRV RNA2的cDNA克隆。其中Lb、Rb：T-DNA的左、右边界DNA序列；RdRp：依赖RNA的RNA聚合酶；35S：CaMV的35S启动子；MCS：多克隆位点；T：转录终止点；16K、29.4K、32.8K分别为病毒编码的蛋白序列；CP：病毒编码的外壳蛋白序列；Int：插入病毒基因的内含子；MPbd的运动蛋白　 TRV是正链RNA病毒，包括两个基因组分，其中RNA1编码病毒在植物中的复制和运动所需的蛋白，RNA2编码病毒组装和介体传播所需的蛋白。在构建载体时把RNA1和RNA2的cDNA分别克隆在植物转化所用的农杆菌的双元载体系统中的两个质粒上，具体结构如图1-2所示。质粒pTRV1克隆含有RNA1全长的cDNA，其RNA聚合酶的阅读框中含有一个内含子，如果缺乏内含子，TRV RNA1的cDNA克隆在大肠杆菌中不稳定。质粒pTRV2克隆含有TRV RNA2的cDNA，质粒的多克隆位点（MCS）取代了其中的非必须蛋白29.4K和32.8K的序列，只留下病毒的外壳蛋白及5’和3’的非翻译区。RNA1和RNA2共同侵染宿主植物后，可产生系统侵染，从而使其携带的外源基因在植物中得到系统表达，随后表现出外源基因沉默的表型。　 材料、试剂、仪器　 材料　　　 土壤农杆菌GV3101 含有pTRV1质粒 (Kana Gen)　 土壤农杆菌GV3101 含有pTRV2质粒 (Kana Gen)　　　 土壤农杆菌GV3101 含有pTRV2-PDS质粒 (Kana Gen)　　 长有3-5片叶子的烟草N.benthamiana 　 试剂　　 液体LB培养基 25ml　　　 悬菌液 25ml　　　 MgCl2 10mM 　　　 MES 10mM 　 乙酰丁香酮 150uM 　 Gen 贮液 50mg/ml　 Kana 贮液 50mg/ml 　　　 仪器　　　 28℃的恒温摇床，离心机，电子天平，pH计，量筒（10ml，100ml，500ml，1000ml），烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），玻璃棒，灭菌的15ml试管6支，灭菌的1.5ml离心管，1000ul移液器,灭菌的1000ul吸头，1ml一次性注射器，及20-25℃的植物温室。　　　 操作　　 实验准备　　 灭菌：25ml LB，100ml蒸馏水，10ml试管6支， 1.5ml离心管约10个，200ul和1000ul吸头。　　 　 图1-3 培养侵染菌液　 　　 培养侵染菌液　　 操作步骤如图1-3所示。　 在超净台内，用液体LB（含有Kans50mg/L Gen50mg/L）分别接土壤农杆菌GV3101 含有p TRV1质粒，土壤农杆菌GV3101 含有pTRV2-PDS质粒，土壤农杆菌GV3101 含有pTRV2质粒，各培养3ml，28℃摇菌17-18小时。　 用1.5ml离心管将3份农杆菌离心收集菌体，用悬菌液分别重悬，并调整OD600=1。　　　 混合菌液1：将含有p TRV1质粒的土壤农杆菌GV3101和含有pTRV2-PDS质粒土壤农杆菌GV3101各0.5