赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体构建及表达初.docVIP

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体构建及表达初 　 作者：黄毕, 鲍朗*, 钟琪, 商正玲, 张会东, 张英 【摘要】 　　目的: 构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS7细胞中表达, 为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法: 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因, 双酶切构建重组质粒pcDNA3.1LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS7细胞, 通过RTPCR、 Western blot检测目的基因的表达。结果: 成功构建了LipL32基因的真核表达载体, 并在COS7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论: 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达, 为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。 【关键词】 钩端螺旋体 外膜蛋白LipL32 真核表达 　　由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种世界范围内广泛分布的人兽共患自然疫源性疾病, 严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家, 遍布三十多个省、 市、 自治区。近几十年来已有数次大规模的流行, 对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低, 但是一旦自然条件发生变化（如洪灾、 地震等）, 极有可能造成局部或全面爆发流行。加上近年来流行菌群的更迭, 缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗, 钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。钩端螺旋体菌型复杂, 仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、 200个以上的血清型, 我国至少可以确定有26个国际新血清型, 是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全, 保护时间短, 菌型间交叉免疫保护性弱。因此, 开发广谱、 高效、 持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体DNA疫苗的研究, 曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备DNA疫苗, 免疫动物后发现该DNA疫苗具有明显的免疫保护作用[2]。LipL32是钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白, 在钩端螺旋体的致病、 免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因为目的基因, 构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞, 旨在为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 钩端螺旋体017株, 本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒pcDNA3.1、 宿主菌E.coli DH5α、 COS7细胞本研究室保存。PCR试剂盒购于TaKaRa公司; 限制性核酸内切酶、 DNA连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品; 脂质体转染试剂、 TRIzol购自Invitrogen公司; DNA提取试剂盒、 胶回收试剂盒、 细胞可溶性蛋白提取试剂盒、 6×His单克隆抗体（mAb）、 DAB显色液购自Tiangen公司; βactin多克隆抗体购于精博生物技术公司; 二抗（羊抗鼠IgGHRP及羊抗兔IgGHRP）为北京中衫公司产品; 其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 钩端螺旋体017株基因组的提取 参照Terpstra等[4]方法并略加修改。 　　1.2.2 LipL32基因PCR扩增 根据GenBank数据库中LipL32基因的序列设计引物, 上游和下游分别引入Kpn I和EcoR I的酶切序列。P1: 5′CGGGTACCGAAGGAGAGTCTATGAAAAAAC3′, P2: 5′GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCCGGAATTCCTTAGTCGCGTCAGAAGC3′（划线部分分别是KpnI和EcoRI酶切位点）（Invitrogen公司合成）。PCR反应体系: 按TaKaRa公司PrimerSTARTMHS DNA Polymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板, P1、 P2为引物, 98℃变性10 s, 55℃退火5 s, 72℃ 90 s, 30个循化。取PCR产物进行80 g/L琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收目的基因。 　　1.2.3 重组载体的构建和鉴定 将载体pcDNA3.1、 LipL32基因分别用Kpn I和EcoR I限制性核酸内切酶双酶切后, 胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4 h。转化宿主菌E.coli DH5α, 挑取阳性克隆摇菌、 提取质粒进行双酶切、 PCR鉴定, 同时将重组载体送Invitrogen公司