基因相关肽制备及其应用初步探究.docVIP

基因相关肽制备及其应用初步探究 　摘要】 目的:对hPTH(134)进行结构改造，提高蛋白水解酶的稳定性，增强酶活性，使之更适合制成滴鼻剂，并验证治疗骨质疏松症的效果。方法：确定将hPTH(134)改造成为ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro后，构建表达质粒pED4PhPTH(134)，转化E.coli BL21(DE3)LysE，乳糖诱导表达，经分离纯化获得目的多肽。将目的多肽与二甲基β环糊精、聚丙烯酸、EDTA制成滴鼻剂，治疗卵巢摘除大鼠（OVXed Rats）的骨质疏松症。结果：获得纯度较高的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro，将制成的滴鼻剂用于卵巢摘除大鼠，与生理盐水滴鼻治疗组相比能显著增加大鼠椎骨骨密度（Plt;0.01）及股骨头骨小梁厚度（Plt;0.001），对鼻黏膜没有损伤。结论：ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症效果明显，有进一步开发的前景。 【关键词】 人甲状旁腺素 滴鼻剂 骨质疏松症 骨密度 骨小梁 骨质疏松症是一种老年人和绝经后妇女的常见疾病，容易造成骨折，降低生活自理能力。甲状旁腺素（PTH）是一种由甲状旁腺分泌的激素，由84个氨基酸组成，是血钙的主要调节剂之一[1]。PTH小剂量多次给药具有明显的成骨作用，PTH（134）则完全保留了这种活性，所以PTH（134）成为目前治疗骨质疏松的理想药物[12]。PTH及其相关肽类药物都采用注射给药，频繁给药给患者带来极大的不便和痛苦。与注射剂相比滴鼻剂具有使用方便、患者依从性较好等特点，因此开发PTH（134）的滴鼻剂具有广阔的市场前景。 多肽类药物滴鼻给药，透过鼻黏膜吸收比较困难，而且易被吸收过程中的蛋白酶所降解[3]，除了从药剂学上来解决此问题，我们认为有必要对hPTH（134）进行结构改造。结构改造有两个目的，一方面为了增强其对蛋白酶的稳定性，避免吸收过程中酶的降解，另一方面增强其活性，弥补多肽类药物生物利用度较低的不足。经过查阅文献，我们选定将hPTH（134）改造为ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro，采用基因工程的方法来获得该肽，并制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症验证其药效。 1 材料与方法 1.1 材料 pET28ansBC为本实验室构建保存，pET28a购自TaKaRa公司，大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存，CM52购自Whatman公司，二甲基β环糊精（DMβCD）购自Sigma公司，SD大鼠由中国药科大学动物实验中心提供，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro表达和纯化 通过PCR方法我们合成编码ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的DNA片断，并将其插入质粒pET28ansBC的BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ两个酶切位点之间得到表达质粒pED4PhPTH(134)。在该表达质粒中，ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro是通过酸敏感位点AspPro连接到大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。将该质粒测序验证后，转化E.coli BL21(DE3)LysE后进行表达，然后经包涵体洗涤，8 mol·L-1尿素溶解，乙醇分级沉淀获得融合蛋白，再经酸水解，CM52柱层析获得目的多肽。 1.2.2 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的HPLC分析 反相柱为Shimpack CLCODS 6.0 mm ID×15 cm，A相为0.1%的三氟乙酸水溶液，B相为纯乙腈，梯度为B相从20%到70%，洗脱时间为20 min，流速为1 ml·min-1，检测波长为280 nm，进样量为20 μl，温度为室温。 1.2.3 ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro滴鼻剂的制备及对卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗 将不同质量浓度的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro（2.500、1.250和0.625 mg·ml-1）、DMβCD(40 mg·ml-1)、聚丙烯酸（2.5 mg·ml-1）及EDTANa（0.1 mg·ml-1）溶解到生理盐水中，调pH 6.0，配制成高、中、低3个浓度的滴鼻剂。 将48只200 g左右的大鼠按体质量分为正常对照（Normal）组，假手术（Sham）组，生理盐水（NS）组，和高、中、低剂量（HhPTH，MhPTH，LhPTH）组，每组8只。对除正常对照