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小鼠几丁质酶重组表达及抗体制备 　【摘要】 目的: 检测脂多糖（LPS）刺激成骨细胞后, 几丁质酶（chitotriosidase）基因表达变化情况。进行小鼠chitotriosidase的原核和真核表达, 并利用原核表达纯化的蛋白, 制备兔抗鼠多克隆抗体。方法: 用LPS刺激MC3T3E1细胞, 提取mRNA, 通过RTPCR获得小鼠chitotriosidase的编码区全长序列, 克隆进pRSET A载体, 转化BL21菌株, IPTG诱导表达。获得的包涵体蛋白用镍柱纯化后, 作为抗原免疫兔子, 制备多克隆抗体。用该抗体检测真核表达的小鼠chitotriosidase蛋白, 并确定抗体的灵敏度和特异性。结果: LPS明显刺激chitotriosidase表达。原核表达的包涵体蛋白经镍柱纯化后也能制备出效果较好的多克隆抗体。结论: 成功地克隆表达了小鼠的chitotriosidase蛋白, 并制备出高灵敏度、 高特异性的多克隆抗体, 为进一步阐明chitotriosidase在病理条件下的表达变化和功能提供了一条途径。 【关键词】 几丁质酶; 脂多糖; 重组表达; 多克隆抗体 几丁质酶（chitotriosidase）是一类特异性水解几丁质的蛋白。虽然在哺乳动物体内还没有发现几丁质, 研究人员已经在人、 大鼠等物种中克隆得到了chitotriosidase及几个相关家族成员, 它们都属于糖水解酶18家族。大量文献报导, chitotriosidase在很多与炎症反应相关的疾病患者体内表达升高。在体外试验中也已证明, IFNγ和TNFα等炎症性细胞因子能够诱导chitotriosidase表达［1, 2］。但是, 该基因的功能目前尚不清楚。我们用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激成骨细胞株MC3T3E1, 发现chitotriosidase表达升高。我们从LPS刺激的细胞中提取RNA, 通过RTPCR得到该基因的全长编码序列, 并进行了该蛋白的原核和真核表达。以原核表达纯化的蛋白为抗原, 制备抗体, 为今后研究该基因的表达调控机制和生物学功能打下了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌BL21为本实验室保存, 质粒pRSET A和 pcDNA3.1D 为Invitrogen公司产品。新西兰大白兔(雄性, 质量250 kg)购自广州中医药大学实验动物中心; 各种限制性内切酶、 dNTP、 Taq DNA聚合酶和Pfu聚合酶购自TaKaRa公司; 转染试剂Lipofectamine 2000, TRIzol和逆转录试剂盒购自Invitrogen公司; 镍柱, LPS, 完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购自Sigma公司; DMEM为Gibco公司产品; 胎牛血清购自杭州四季青公司; 抗Histag抗体购自Merck公司; HRP偶联的羊抗兔二抗, 增强化学发光(ECL)检测试剂盒为KPL公司产品。蛋白定量试剂盒购自Biorad公司。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。小鼠来源的成骨细胞株MC3T3E1购自中国医学科学院细胞中心, cos7细胞为本试验室保存。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养和LPS刺激细胞方法 MC3T3E1细胞培养在DMEM（含100 mL/L FBS）, 置于37℃、 50 mL/L CO2温箱中。待细胞达到90%汇合时, 接种6孔板。过夜后, 加入LPS至终浓度为10 mg/L。检测chitotriosidase的表达变化的引物序列: 上游引物: 5′GACCCTGTTAGCCGTTGG3′, 下游引物: 5′CTTGGAGTCTCGGATGGA3′。PCR产物经测序证明序列正确。 1.2.2 小鼠chitotriosidase编码区全长序列的获得和真核与原核表达质粒的构建 LPS刺激细胞6 h后, 弃去培养液, 直接加入1 mL TRIzol。然后按照说明书提取总RNA, 反转录得到cDNA。用PCR的方法获得chitotriosidase编码区的全长序列（不含信号肽）, 在引物的末端分别加入Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点。引物序列为: 上游引物5′GATCTCGAGGCAAAACTGGTCTGCTACCTC3′, 下游引物5′CTAGAATTCGCTCCAGGTACAACATTTGC3′; 克隆到pRSET A载体, 命名为chpRSET。另外设计一对引物, 在末端分别加入Xba Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点。引物序列为: 上游引物5′ATGCGGCCGCATGGTGCAGTCCCTGGCCT3′, 下游引物5′CTATCTAGAGCTCCAGGTACAACAT