干扰CLC2基因表达对人眼小梁细胞细胞周期进程影响.docVIP

干扰CLC2基因表达对人眼小梁细胞细胞周期进程影响 　【摘要】 目的 观察抑制CLC2基因的表达对人眼小梁细胞细胞周期进程的影响。方法 构建针对CLC2的小干扰(siRNA)重组表达载体，脂质体LipofectamineTM2000介导转染人眼小梁细胞后，应用RTPCR半定量检测小梁细胞CLC2 mRNA表达量的变化;流式细胞仪检测干扰CLC2表达后，人眼小梁细胞细胞周期进程。结果 与空载体组比较，重组载体组的CLC2 mRNA表达明显降低，且有效抑制小梁细胞由G0期到G1的转位。结论 抑制CLC2的表达可以干扰人眼小梁细胞正常细胞周期进程。 【关键词】 CLC2;小梁细胞;RNAi 　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of CLC2 suppression by antisense oligonucleotide on cell cycle of human trabecular meshwork cells. Methods CLC2 mRNAtargeted hairpin siRNA was designed and constructed, and transfected into cultured human trabecular meshwork cells by LipofectaminTM2000. RTPCR semiquantitative was applied to detect the expression of the cell′s CLC2 gene, and flow cytometry was performed to detect the change of cell cycle on interfered human trabecular meshwork cells. Results The expression of CLC2 gene in siRNA interfered groups was significantly lower than that of control group, and the cell cycle of siRNA interfered human trabecular meshwork cells was effectively inhibited from GO to G1 phase. Conclusions To inhibit the expression of CLC2 can effectively interfere cell cycle of the human trabecular meshwork cells. 　　【Key words】 CLC2; Trabecular meshwork cells; RNAi 　人眼房水外流阻力主要来自于小梁网(trabecular meshwork,TM),小梁细胞作为小梁网的内皮细胞，其形态、数量及功能的异常改变，必将引起房水外流受阻，导致原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)的发生和发展〔1，2〕。根据流行病学调查，POAG多发生于50～70岁的中老年，30岁以下较少发病。氯离子通道作为一种对氯离子或其他阴离子有通透作用的蛋白通道，在维持细胞的容积平衡、调节细胞内pH值、细胞迁移、细胞增生分化及凋亡过程中发挥重要作用〔3〕。近年关于离子通道参与POAG形成的研究逐渐深入，特别是氯离子通道的作用更受重视〔4〕，本研究将构建的CLC2反义寡核苷酸转染入人眼小梁细胞，观察其对人眼小梁细胞细胞周期的影响，为探讨POAG的基因治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和主要试剂 永生株人眼小梁细胞(中山大学眼科中心卓业鸿教授惠赠);DMEM/F12培养液、磷酸缓冲液(PBS)和胎牛血清(Gibco公司);pSUPER.puro载体、E.coli JM109和碘化丙啶(PI，OligoEngine公司);LipofectamineTM2000、RTPCR试剂盒和Trizol(Invitrogen公司);DNA marker(TaKaRa公司)，其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人眼小梁细胞体外培养 用含15%胎牛血清的DMEM/ F12培养液培养人眼小梁细胞，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。本实验取第3～4代，生长良好、近融合数量恒定的细胞进行实验。 　　1.2.2 重组表达载体构建与鉴定 在GenBank上查找CLC2基因序列，查阅相关资料、应用siRNA设计软件帮助辅助设计CLC2反义核苷酸序列，根据