质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性-.PDFVIP

生物 医学工程学杂志 2006 JBiomedEn g )23(3)：’615~ 619 质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性-)6 李 燕 李明远 彭 颖。 蒋中华 李婉宜 李 虹 1(四川大学 华西基础医学与法医学院病原生物学教研室，成都 610041) 2(四川维奥制药有限公司，成都 610041) 摘要 为 了探讨靶向人端粒酶反转录酶 (hTERT)基 因的小干扰 RNA(siRNA)表达载体是否具有抑制 HeLa 细胞端粒酶活性的能力，人工合成 2条 64个核苷酸 (nt)的片段 ，其中 19nt与 hTERT基因 1789—1807位碱基 同源， 将其退火、连接到质粒 pSUPER 中，构建 pSUP—hTE。在 pSUP—hTE基础上 ，把该质粒的启动子和64nt插入片段酶 切 、克隆到质粒 pEGFP-C1中生成 pEGFP—hTE，从而获得新霉素抗性筛选质粒 。将 pEGFP—hTE用脂质体转染 HeLa细胞，G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代，用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋 白表达水平、 HeLa细胞 的端粒酶活性 以及细胞 的增殖能力 。结果显示 ，pEGFP—hTE转染的HeLa细胞与对照组 比较 ，hTERT 的mRNA水平下降及蛋 白表达减少、细胞端粒酶活性降低 38 ，但细胞增殖能力没有 明显改变 。以上结果表 明， pEGFP—hTE能通过RNA干扰 (RNAi)途径特异性抑制 HeLa细胞 hTERT基 因的表达 ，从而有效抑制细胞端粒酶 活性，这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新 的途径 。 关键词 pSUPER RNA干扰 人端粒酶区转录酶 抑制端粒酶活性 Suppression ofTelomeraseActivitybyPlasmid—mediatedRNA Interference LiYan LiM ingyuan PengYing JiangZhonghua LiW anyi LiHong 1(DepartmentofMicrobiology·WestChinaSchoolof PreclinicalandForensicMedicine，SichuanUniversity．Chengdu 610041．China) 2 (SiChuanVitalPharmaceuticalsCo．．Ltd．Chengdu 610041．China) Abstract ThisstudywasaimedtoconstructaplasmidexpressingsiRNA specificforthehumantelomerase reversetranscriptase (hTERT)geneandtoevaluatetheabilityofsmallinterferenceRNA(siRNA)forinhibiting telomeraseactivity in HeLacells． 64nucleotides，in which 19ntwerehomologouswith hTERT gene．were chemicallysynthesized，annealedandlinkedintopSUPER togetpSUP—hTE．ThenpSUP—hTEwasdigestedwith enzyme．W eobtaineditsfragmantconcludingpromoterand64nt．SowecloneditintopEGFP—C1forconstructing pEGFP—hTE whichcontainsneogeneandtheenhancedgreenfluorescentprotein (EGFP)．RecombinantpEGFP— hTE wastransfectedtoHeLacells．Thesecellswerescreenedwithmedium containingG418 W henstablecolonies