三七皂苷对内皮细胞MMP-活性、巨噬细胞炎症因子表达及血小板凝集抑制作用实验的研究.pdfVIP

参与了AS斑块形成的全过程，即血小板本身有致斑块性，血小板参与体内血脂 调节、促进炎症及致氧化应激作用。所以有效抑制血小板的活性可以减缓AS的 发生与发展。 三七为五加科植物参三七的根，主产于云南、广西等省。三七含有多种化学 成分，其中三七总皂苷(totals印onins ofpanaxnotoginseng，PNS)为主要有效活性成 分，人参皂苷Rbl、人参皂苷R91为从中提纯所得的单体皂苷。三七皂苷对心脑 血管系统、血液系统、神经系统、免疫系统等均具有广泛的作用，而且能抗肿瘤、 抗衰老等，临床上广泛地应用于心血管疾病、肝炎、外科疾病的治疗。因此，三 七是一味具有广阔开发应用前景的药物。但是其抗动脉粥样硬化的具体机制研究 较少，其单体成分人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl在治疗动脉粥样硬化中的作用尚 不明确。 time 本实验中我们用Real nowch锄ber 噬细胞分泌IL-6，MCP-1的影响；利用the microchip syStem观察不 同浓度PNS，Rbl，R91对血小板凝集的影响：用明胶酶谱实验观察不同浓度PNS， Rbl，Rgl对人脐静脉内皮细胞MMP．2活性的影响。进而探讨三七皂苷在抗动脉 粥样硬化中的作用机制。 实验方法 一、细胞培养 (一)T唧．1源性巨噬细胞的培养 和湿度条件下的细胞培养箱中培养。细胞悬浮生长，在用PMA(50n∥m1)刺激 贴壁分化为巨噬细胞后用于实验。 (二)人脐静脉内皮细胞的原代分离与培养 将取来的脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提fi{f盛有预热 PBS培养皿中，剪去有钳央痕及血肿的部分，挤出脐带中的残血，用剪刀修齐两 断面。找出脐静脉，用带平针头的注射器从一端插入脐静脉，血管钳固定，再用 预热的PBS冲洗3次以上，将血迹完全冲洗干净。从冲洗的针头中注入0．25％胰 2 酶消化液使其充盈。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37 ℃培养箱中孵育7min。取出烧杯，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液， 然后注入含10％胎牛血清的DMEM培养液再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并 20％胎牛血清)，用巴氏吸管轻轻吹打均匀，3×104／cm2接种于培养皿，置于5％C02， 37℃培养箱中培养，24h后更换培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24h半定量 换液1次至细胞生长铺满皿底。待细胞生长达亚融合状态进行传代，2代细胞用 于实验。 二、Realtime RT-PCR检测巨噬细胞I“和MCP．1ml州A的表达 收集待测巨噬细胞，进行RNA抽提，反转录后按下列条件在荧光定量PCR 仪上扩增：GAPDH：95℃10sec 45Cycle：IL·6：95℃10sec MCP．1：95℃10sec 算ml酬A的相对表达量。每个样本设3个复孔。 三、体外血小板凝集试验 取人新鲜血液于含枸橼酸钠的试管中，混匀，再将血浆分装至EP管(380“l／ 上下摇晃3次混匀，5分钟后使用ne flowchamber microchip system检测血小板凝 集。 四、明胶酶谱实验测定人脐静脉内皮细胞中MMP．2的活性 取对数生长期人脐静脉内皮细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为 2×105／ml，接种于24孔板，培养24h后去上清：加入无血清培养液继续培养24 小时，使细胞生长同步化：再次吸出培养液，分别加入含有200p∥ml，500pg／ml， 1 1及50“g／ml，200“g／ml， 000pg／ml，PNS：50pg／ml，200pg／ml，500p∥ml，Rb 500州ml，R91的无血清DMEM培养液，以不含三七皂苷的孔为对照组，每浓度 平行3孔，继续培养24小时后取上清。上清按5：1与上样缓冲液混合室温放置