酵母双杂交系统原理及具体操作流程.pptVIP

Troubleshooting Guide A.Constructing DNA-BD fusions DNA-BD/bait activates reporter genes Bait protein is toxic to yeast cells B. Generating cDNA libraries Low yield of dsDNA Size distribution of dsDNA is less than expected Presence of low molecular weight (0.1kb) in dsDNA fragments C. Constructing Screening Y2H Low transformation efficiency Low mating efficiency Excessive background growth on library screening medium Failure to detect known protein-protein interaction 酵母单杂交的实验过程（附） 报告载体的构建（pHIS2/target DNA),插入片段为60bp左右 报告载体酶切鉴定图 感病组织RNA的提取 通过SMART（Switching Mechanism at the 5’ end of the RNA Transcript) 技术进行 cDNA的合成，通过LD-PCR扩增ds cDNA 取1μg 总RNA 具有接头（SMART III CDSIII)的ds cDNA 总RNA电泳图 ds cDNA(0.4~4kb)电泳图 酵母感受态的制备 在含有不同浓度3-AT的营养缺陷型培养基（SD/-His/-Trp)上筛选，以确定抑制背景的适当3-AT浓度 报告载体转化酵母Y187 通过一步法构建及筛选AD融合文库 酵母感受态的制备 文库的构建（一步法） 单杂交筛选 将转化子铺在含有适当浓度3-AT的营养缺陷型（SD/-Trp/-Leu/-His）的平板上，筛选阳性克隆 将1：100及1：1000稀释液分别铺在营养缺陷型SD/-Trp 及SD/-Trp/-Leu的平板上以确定感受效率 以下三个培养皿从左到右3-AT的浓度分别为20mM、40mM、60mM；可以说背景用60mM的3-AT抑制不住。这说明插入报告载体的元件可能及酵母的内源蛋白互作，则这个元件不宜用酵母单杂交来分析。 1.SD/-Trp: 3.4×106 cfu/5μg pHIS2/target DNA 2.SD/-Leu: 3.6×106 cfu/3μg pGADT7-Rec2 DNA 3. SD/-Leu/-Trp: 8.0×105 个/文库 酵母双杂交系统原理及具体操作流程 酵母双杂交系统可进行两个蛋白互作分析，可用一个已知的蛋白因子（在双杂交系统中称为诱饵蛋白）去钓取及其结合的蛋白；也可用进一步验证两个蛋白之间的互作。应用Clontech第三代酵母双杂交系统，并在按实验手册要求的严格操作下进行蛋白互作分析，我们的筛选结果将具有较好的重复性与可靠性。 单、双杂交的方法是基于许多真核生物转录因子都是以模块形式存在的，它们的转录激活域和DNA结合域在结构和功能上都有区别。这就允许研究者去构建不同的融合基因，当在酵母中表达融合蛋白，能立即结合DNA靶序列激活下游启动子的转录（图1所示），BD Matchmaker系统应用酵母中已经研究透彻的转录因子GAL4的转录激活域和DNA结合域来进行研究。 单杂及双杂的异同点 酵母单双杂，都基于许多真核生物转录因子的转录激活域和DNA结合域在结构和功能上都有区别。这就允许研究者去构建不同的融合基因，当在酵母中表达融合蛋白，就能结合DNA靶序列激活下游启动子的转录。单杂交是文库中的转录因子直接及靶序列结合，使与转录因子融合的GAL4AD激活报告基因HIS3的转录，而双杂是借助与诱饵蛋白与文库中调控因子的互作，使得GAL4BD和AD通过这个“桥梁”共同起作用，激活报告基因（ADE2、HIS3 、 lacZ和 MEL1）的转录。 推荐使用Clontech公司的第三代载体，pGADT7-Rec 和pGBKT7进行双杂交筛选，因为它们产生更少的假阳性。对于cDNA合成，构建一个及GAL4激活域的融合文库，在双杂交中推荐使用pGADT7-Rec，这一克隆是通过体内同源重组来实现的（图2），这一步骤是利用酵母中的高效重组系统使ds DNA与GAL4 AD质粒融合。借助于同源重组克隆，文库的构建和筛选能快速接连地进行（步骤