非停跳冠脉搭桥对大鼠心肌细胞TLR4及TNF-α活性表达的影响.pdfVIP

山东大学硕士学位论文 续性缺血导致组织损伤和细胞死亡，早期再灌注能够减轻心肌缺血的损伤程度， 但是大量的动物实验和临床观察，再灌注后在改善心肌供血的同时又加重了单纯 心肌缺血所造成的损伤，出现心律失常、梗死面积扩大、持久性心室收缩功能低 下等状况。病理变化可出现心肌细胞水肿、细胞膜和细胞器膜完整性破坏、肌纤 维出现破坏性断裂超微结构的改变、微血管损伤和无再灌注现象等。因此，IRI 成为影响患者缺血／再灌注后心脏结构和功能恢复的主要因素。心肌缺血再灌注 ischemia 损伤(myocardial reperfusioninjury,MI／RI)是一个复杂的多因素、多途 径的病理生理过程，近年来研究表明某些炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子．伐 (TNF．a)、白细胞介素．6(IL．6)等介导的炎症反应及细胞凋亡在其发生中起 like 着重要作用11-3I。Toll样受体4(Toll4,TLR4)是新近发现的天然免 receptor 疫中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体，在介导上述细胞因子活化的信号传导 通路中扮演着重要的角色I训。有资料显示，TLR4信号传导缺陷可明显减轻缺血 再灌注期间与心肌损伤加重相关的炎症反应，提示TLR4可能介导了MI／RI的炎 症反应ISatl。心肌缺血再灌注早期，心肌TLR4的表达是否改变，TLR4表达与炎 性细胞因子释放增加是否相关尚不清楚。本研究旨在通过观察心肌缺血再灌注早 期大鼠心肌TLR4表达变化的规律及其与TNF—a之问的关系，初步探讨TLR4 在MI／RI中的作用。 5 山东大学硕士学位论文 材料与方法 1．动物分组及模型建立：健康Wistar大鼠60只，不分雌雄，体重在250．3009， 山东大学医学院动物试验中心提供。将60只大鼠随机分为假手术组(Sham组， 腔内注射3％戊巴比妥(30mg／kg)麻醉，仰卧位固定，四肢皮下插入针形电极描 记心电图：左侧胸前区备皮，于胸骨左侧O．5一Icm处纵向切口，上界为两前肢 连线，下界为第5肋间，依次切开皮肤、深浅筋膜，钝性分离胸大肌、前锯肌， 暴露肋骨。完全止血后，横断3、4肋骨及肋间肌，剪丌胸膜，用后颅凹撑丌器(神 经外科手术器械)撑丌胸壁暴露心脏，打丌胸腔后操作一定要迅速，用镊子提起 心包并小心撕开充分暴露，以左心耳与肺动脉圆锥间的左冠状静脉主干为标志， 向右侧旁开约0．5mm，用7—0无创伤缝线穿过左冠状动脉前降支，进针深度约为 0．5mm，然后将缝线穿过事先准备好的长约2—3cm的乳胶管中，将乳胶管一端留 置在胸腔中，迅速关闭胸腔(注：打丌胸腔后，动作一定要迅速，因大鼠『F处于 气胸状态下，争取在一分钟内完成操作，关闭胸腔，解除气胸)。用空针行胸腔 穿刺，尽量抽出胸腔内气体，纠正气胸。待大鼠呼吸平稳后，通过牵拉无创伤缝 线，同时下压乳胶管以阻断冠状动脉自订降支，造成急性心肌缺血。牵拉力量要适 度，以免撕裂心肌及冠脉。阻断三分钟后，取出乳胶管，使冠状动脉再通，实现 缺血部分再灌注。以此过程模拟非停跳冠脉搭桥时的缺血再灌注过程。整个实验 过程同步记录手术前后的多导联心电图，以收紧结扎线后心电图ST．T抬高，放松 后抬高的ST-T下降l／2以上为模型建立成功。按照不同的灌注时间Oh(心肌缺血 左心室心肌(前壁近心尖部)，迅速液氮冻存，进行相关指标检测。Sham组模 型制备方法同上，但只穿线不阻断冠状动脉，对应时间点处死动物取材。 (1) 2．逆转录聚合酶链反应(RT．PCR)检测心肌组织TLR4mRNA的表达： 总RNA的提取：用TrizolRNA提取试剂盒(全式金公司)对保存在液氮中的标本 总RNA进行抽提与纯化。 6 山东大学硕士学位论文 盒(全式金公