京郊保护地蔬菜轮作方式对南方根结线虫种群的影响.pdf

第一章 北京地区蔬菜保护地根结线虫种类调查 置显微镜观察雌虫会阴花纹，并照相。 1．2．4分子生物学鉴定方法 过测序、比对rDNA—ITS序列确定根结线虫分类地位。 1．2．4．1单条线虫DNA的提取方法 参照廖金玲(2001)微量提取法并加以修改。在体视镜下用解剖针挑取已分离 好的根结线虫幼虫或雌成虫；用蒸馏水冲洗，在I％次氯酸钠溶液中消毒三分钟， DTT，1．125％ 再用蒸馏水冲洗三次以上。挑入滴有10肛l预冷WLB液(2．5mmol／L mmoVL mmo／咒KCL，25 吐温20．0．025％明胶，2．5倍PCR缓冲液f125 mrnol／L Tris．CL(pH8．3)，3．75MgCL2])的载玻片上，在解剖镜下用消毒的眼科手 术手将线虫切成多段，然后迅速吸取含尽量多的这些线虫片段的悬浮液8uL，加 入含10u rain。即得到DNA悬浮液，在--20℃条件下保存。 后以14000rpm离心l 1．2．4．2PCR扩增 引物： et 应用Vrmn 5-TTOAT et 于核糖体DNA的18S基因和5．8S基因上(PoweLa1．1997)(图i-1)。 lTSl lTS2 188 f 588 7 28S 图1-1扩增序列位置 PCR反应体系： PCR Mix 采用便捷式PCR试剂盒2×TaqSuperf清华大学北京天为时代科 技有限公司)。其中己加入PCR反应所需的全部试剂(除模板和引物外)，Taq KCl、1，5mM MasterMix反应终浓度：10mMTris．HCI(pH8．3)、50raM MgCL2、 tOuMdNTPeach、1U 第一章 北京地区蔬莱保护地根结线虫种类调查 时，只需取适量混合液，加入模板和引物后加水辛}足体积即可进行反应。 反应体系为50 uL，按下表配制混合液： Templar 0．5肚g Primer 1uL rDNA2(10”旧 PrimerrDNAl 1uL 58s(10l_tM) 2xHifi PCR 25uL LongTaqSuperMix ddH20 22．59L 总体系 50}_tL 反应条件： 94C预热4min， 94℃变性lmin] 60℃褪火]rain L35个循环 72℃延长1．5min 。 72℃保温lOmin 4C保存 1．