丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因克隆及其在大肠杆菌中表达.docVIP

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因克隆及其在大肠杆菌中表达 　 作者：付慧，楚雍烈，张丽莉，曹美茹，成凡，茹小荣，王勇健 【摘要】 目的 克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法 运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDSPAGE电泳及Westernblot检测NS5A蛋白的表达水平。结果 成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论 成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。 【关键词】 丙型肝炎病毒；ns5a基因；基因表达 　　Cloning and expression of ns5a gene of hepatitis Cvirus 1b strain DY in Escherichia coli 　　ABSTRACT: Objective To clone and express the ns5a gene of hepatitis C virus (HCV) 1b strain DY. Methods By using the prokaryotic cell gene engineering, HCV ns5a gene was amplified with nested PCR from the plasmid HCV17 of HCV 1b strain DY fulllength gene and inserted into the cloning pMD18T vector. The cloned HCV ns5a gene was separated and subcloned into expression vector pET28a and induced by IPTG in E.coli. BL21.The expressed product was identified by SDSPAGE and Westernblot methods. Results Recombinant expression plasmid pet28ans5a was constructed and expressed successfully. Conclusion HCV ns5a gene was cloned and expressed. This might be helpful for further studies on the nature and biological properties of the ns5a gene. 　　KEY WORDS: hepatitis C virus (HCV); ns5a gene; gene expression 　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV)是人类血源性传染病的主要病原之一。全球范围内HCV感染人数约为1.7亿[1]，其感染率约为全球人口的3%；我国有将近4000万人感染。HCV感染与肝脏病变密切相关,且易呈慢性化及恶性化发展。目前对HCV感染的治疗效果有限，而且尚无预防HCV感染的疫苗，故HCV感染已成为全球性严重的社会公共卫生问题。 　　HCVns5a基因位于HCV基因组中6258-7601nt，编码约448个氨基酸，NS5A蛋白为高度磷酸化蛋白[2]，是一个很有争议的“多功能”蛋白，对其结构及功能的研究对探讨HCV的致病机理、感染的检测、治疗及疫苗开发等均有非常重要的意义，尤其是NS5A蛋白之中是否存在干扰素敏感性决定区(interferon sensitivity determining region, ISDR)及ISDR与干扰素(IFN)疗效之间关系的研究成为近年来HCV研究的热点内容。 　　由于HCV在细胞培养体系中复制效率较低，通过重组表达获得有活性的NS5A蛋白是研究该蛋白功能最有效和实用的方法。因此，本研究对分离自我国丙型肝炎患者血清的HCV1b DY株ns5a基因进行克隆、序列比对和生物信息学分析，构建该基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达NS5A蛋白，鉴定所表达蛋白的抗原性，为研究NS5A蛋白的结构、性质和生物学功能创造条件。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒、菌株及载体 HCV全长cDNA质粒HCV17、E.