内毒素对人树突状细胞的影响体外的研究.pdfVIP

山西医科大学硕士学位论文 实验一正常人外周血树突状细胞的体外诱导培养 1．实验材料 1．1实验对象 选用我校在校大学生健康志愿者17例，其中男性9例，女性8例，平均年龄21岁 (19～23)岁。在知情同意的情况下采集每人10ml夕b周静脉血。 1．2主要试剂 rhlL一4：PEPROTECH Company(5×104U／支) rhGM-CSF：PEPROTECH 05U／支) Company(1×1 rhTNF—a：PEPROTECH 105 U／支) Company(2X Flt3．L：PEPROTECH 103／支) Company(2x LPS：Sigma公司 RPMI 1640：Gibco公司 FCS：Hyclone公司 淋巴细胞分离液：上海试剂二厂(Histopaque，1．077g／m1) 1．3主要仪器 超净工作台：JTT一7A，北京半导体设备厂 C02培养箱：CellHouse200，Hcto ．20℃低温冰箱：BCD212，青岛利渤海尔 ．80℃低温冰箱：MDF．38AF，日本 电热恒温水浴箱：DK．80 台式离心机：TGL．16B，上海科学仪器厂 HC．TP．12型架盘天平：天津市天平仪器有限公司 倒置显微镜：XSE，重庆 微量加样器：GILSON，法国 12孔培养板：ComingIncorporated，USA 1 4试剂配制 1．4．1 PBS液：KCl 12H20 0．29、KH2P040．29、NaCl8．09、Na2HP043．499力口ddH20至 1000ml，PH 7．2～7．4，分装至500ml灭菌瓶中高压除菌。 1．4．2RPMI 1640粉，加入500ml 1640液：取1袋RPMI ddH20中，玻璃棒搅拌均匀，分 别称量Hepes2．389和L-Gin0．2229搅拌均匀，直至ijl640液变澄清，颜色发黄，然后再加入 已溶解好的2．Og 和链霉素(100u／m1)，用1N 250ml输液瓶，备用。使用时加入FCS使成为含FCSl5％的RPMI1640完全培养液。 E 存。使用时10mlP]周血取2ml稀释肝素钠抗凝。 1．4．4台盼蓝染液：台盼蓝49，加少量三蒸水研磨，再加三蒸水至100ml，滤纸过滤，4 ℃保存，用时以PBS稀释至0．4％。 2．实验方法 2 bIoodmonorlLIcIear 1外周血单个核细胞(peripheral ce|l，PBMC)的分离 (1)采集健康志愿者外周血10ml置于50ml无菌瓶中，40u／ml肝素抗凝。 (2)在采集后1小时内用温热至37。C的PBS液稀释1倍，用吸管吹打混匀。 (3)在洁净玻璃离心管中加入淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血沿管壁轻轻加在 淋巴细胞分离液面上使成界面。淋巴细胞分离液与抗凝血的体积比为1：l，以2500rpm，离 条带。收集界面单个核细胞即白膜层于另一无菌玻璃管中。 (5)以含FCSl5％的RPMI1640完全培养基悬浮沉淀细胞，用吸管轻轻吹打混匀，调 整细胞浓度到3～5×106／ml铺于12孔板中。 2．2DC体外定向诱导分化和培养 按照Romani[”】等分离培养树突状细胞方法稍作修改： 轻沈出未贴壁细胞。 (2)贴壁细胞加含FCSl5％的RPMI1640完全培养基于12孔板中，每孔lml，按含 rh