桃儿七内生真菌分离及其活性产物初步探究.docVIP

桃儿七内生真菌分离及其活性产物初步探究 　［摘要］ 目的 从药用植物桃儿七中分离的内生真菌中筛选出能产生木脂素类化合物的菌株。方法 用常规微生物学方法从桃儿七植株中分离出其内生真菌，分别对各菌株的提取物进行薄层层析，通过在紫外检测仪下观察和用浓硫酸-乙醇显色定性。结果 从桃儿七根、茎中共分离出21株内生真菌，其中编号为T8的菌株的菌丝体和发酵液提取物经TLC分析，都出现了与标准品颜色和Rf值相同的斑点。结论 该菌株应该具有产生鬼臼毒素或其类似木脂素类化合物的能力。 　　［关键词］ 桃儿七；内生真菌；鬼臼毒素；木脂素；药用植物 　　药用植物桃儿七（sinopodophyllum hexandrum）是我国一级保护植物［1］，其主要药用成分是以鬼臼毒素（podophyllotoxin）为代表的木脂素类化合物，具有显著的抗肿瘤活性以及治疗尖锐湿疣和抑菌等作用［2～4］。近年来对鬼臼毒素类药品的市场需求量剧增。但由于桃儿七种群分布区域有限，生长较为缓慢，且植物体内有效成分含量较低，加之人类的大量采挖，野生资源已经处于濒危状态。因此，仅靠从天然植物中提取有效成分已很难满足市场需求。 　　由于内生真菌在植物体内普遍存在，而且某些内生真菌能产生和其宿主植物相同或相似的活性物质［5，6］，因此，如果能从桃儿七植株中分离并筛选出可以产生鬼臼类木脂素的内生真菌，就有可能利用工业化发酵方法生产。这样不仅可以开发该类植物药生产的新途径，改善市场供应，也对保护这种珍贵的植物资源和生态环境具有重要意义。　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 桃儿七植株采自陕西省太白山自然保护区。 　　1.2 标准品 鬼臼毒素购自西安润德公司。 　　1.3 培养基 马丁培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和马铃薯葡萄糖液体培养基均按的配方配制［7］。 　　1.4 内生真菌的分离和纯化 将植物样品按常规方法消毒后，在无菌条件下分别将其根、茎切成约0.5 cm长的小段，接种于马丁平板上，置25 ℃恒温培养箱中培养。材料边缘长出菌丝后，按常规微生物学方法分离，纯化后编号并转接到PDA斜面上保存。 　　1.5 摇瓶培养 刮取PDA平板上生长的各菌株的菌丝体制成悬液，等量接种于装有50 ml马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶内，置每分钟振荡110次左右的往复式摇床上培养，温度25 ℃。 　　从接种后的第2天开始，每天取3瓶培养物，用已预先称重的滤纸抽滤，滤液备用；滤出的菌丝体在60 ℃烘箱中烘至恒重，冷却后用天平称重，绘制生长曲线并分别对其中的活性成分进行初步的定性检测。 　　1.6 菌丝体和培养液中活性成分的检测 将摇瓶灌养中所得的干菌丝体冷冻后研碎并用80%乙醇回流、过滤、浓缩后再加氯仿萃取；发酵液浓缩后也用氯仿萃取。二者的氯仿萃取液浓缩后，分别点样于加有3% CMC的硅胶G薄板上进行薄层层析（TLC）。展开剂为氯仿∶甲醇（85∶15，v/v）；显色剂为浓硫酸-乙醇 （1∶1，v/v），显色条件为120 ℃，5 min［8］。 　　2 实验结果与讨论 　　2.1 内生真菌的分离及初步薄层分析 从桃儿七根、茎中共分离得到21株真菌。经分别培养和初步的TLC分析，有3种真菌的菌丝体提取物与鬼臼毒素标准品的Rf值基本相同，而且编号为T8的菌株发酵液提取物也出现了与标准品相同Rf值的斑点，说明该菌种不仅可能产鬼臼毒素或类似的代谢产物，而且在胞内外均有产生。因此，进一步的工作以T8为材料进行扩大培养，合并菌丝体和发酵液的氯仿提取物再进行TLC分析。 　　　2.2 T8菌株提取物的薄层层析 T8样品的提取物浓缩液经薄层展开后，晾干，置于紫外检测器下观察可见2个荧光斑点。再用浓硫酸-乙醇显色后，其中迁移速度较快的斑点呈紫红色，且与标准品的Rf值相同（见图1），再次证明该菌株具有产生和其宿主相同的鬼臼毒素或其类似物的能力。另一迁移较慢的斑点为黄棕色，其性质还有待进一步研究。 　　图1 T8菌株提取物的薄层层析结果　略 　　目前国内外已有一些从不同产地和不同植物中分离的内生真菌中筛选出能产生鬼臼毒素和其他药用活性成分菌株的报道［5，6］，例如从桃儿七［8］、川八角莲（dysosma veitchii） ［9］和南方山荷叶（diphylleia sinensis）［10］等植物中都分别分离得到了产鬼臼毒素或其类似物的内生真菌。由此可见，内生真菌有着产生和它的宿主植物相同或相似成分的能力，是具有一定普遍性的现象，这些都显示出利用内生真菌培养生产相关植物药用成分（包括鬼臼毒素）的可能性。但是目前这类研究还处于起步阶段，且从内生真菌提取物中获得的活性成分含量还很低，尚不能满足进行工业化生产所需的水平。因此，有必要对此作更深入、全面的研究，以解决资源、环境保护和人类需求之间的矛盾。