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解脲脲原体DNA模板制备方法探究比较 　 作者：盛敏玲，濮跃晨，朱长太，姚余有，赵政龙，卫广英，赵卫东，高婷 【关键词】 解脲脲原体；检测；模板制备；PCR 　　［摘 要］ 目的：从蛋白酶K法，酚-氯仿法，双蒸水煮沸裂解法中遴选出提取UuDNA的较好方法。方法：分别以双蒸水煮沸裂解法，蛋白酶K法(PK法)及酚-氯仿提取法提取UuDNA模板并作比较。结果：PK法及酚-氯仿提取法比较两法无差异，双蒸水煮沸裂解法与酚-氯仿提取法比较前者敏感率较低。结论：应用PCR检测Uu，PK法及酚-氯仿法均可用于UuDNA模板的提取，而双蒸水煮沸裂解法不主张应用。 　　［关键词］ 解脲脲原体；检测；模板制备；PCR 　　解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)属脲原体(Ureaplasma)，无细胞壁及前体，细胞器极少，由于Uu通过性接触、分娩时经产道等途径传播，故而Uu感染引起的疾病也被列为STD疾病范畴。 　　研究Uu与疾病的关系最早是从非淋病性尿道炎开始的。近年来，大量研究证实：Uu与非淋病性尿道炎、前列腺炎、睾丸炎、尿结石、膀胱结石、妇科疾病、新生儿低体重、新生儿肺炎等多种疾病有关。由此，Uu对人体健康的危害不容忽视，有必要对其进行检测和治疗。 　　目前，Uu检测的方法主要有培养法、PCR法等。对于PCR方法检测Uu，关键环节之一是UuDNA的提取。而对于UuDNA的提取成功与否，DNA提取方法的选择至关重要。由于Uu属原核微生物，其细胞特性与细菌相似，故结合文献报道［1～3］选取三种方法(经典的酚-氯仿提取法、PK法及双蒸水煮沸裂解法)作为候选方法提取UuDNA，扩增后对其结果进行比较，以遴选出提取UuDNA的较好方法。 　　1 资料与方法 　　1.1 标本来源与采集 　　全部检测对象来自于性病科、妇产科、泌尿外科。标本采集：男性，以一次性无菌拭子深入尿道2 cm～3 cm处取尿道分泌物(轻轻转动并停留10 s后取出)；女性，以一次性无菌拭子在宫颈口处取上皮细胞。其中，男性29例；女性33例，合计62例。 　　1.2 UuDNA模板的制备 　　1.2.1 双蒸水煮沸裂解法 　　标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min，弃上清。加入500 μl双蒸水，100 ℃煮沸20 min，离心(15 000 r/min,10 min )。取上清液加入500 μl 0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 mol乙酸钠(pH 4.8), 4 ℃离心去上清液。沉淀用70%乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20℃或4℃保存。 　　1.2.2 PK法 　　标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min; 弃上清，加300 μl裂解液及2.0 mg/ml蛋白酶K 100 μl，55 ℃孵育1 h后,98 ℃作用20 min。加入400 μl 0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 mol pH 4.8乙酸钠,4 ℃离心去上清液。沉淀用70%乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20℃或4℃保存。 　　1.2.3 酚-氯仿提取法 　　标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min; 弃上清。加入500 μl裂解液(含1/10体积酚),(65 ℃预热),95 ℃10 min。加入等体积苯酚-氯仿-异丙醇,65℃放置30 min，间隔5 min～10 min轻摇一次, 离心(15 000 r/min,5 min)。取上层水相加入等体积的氯仿-异丙醇液65 ℃放置30 min，间隔5 min～10 min轻摇一次, 离心(15 000 r/min,5 min )。取上层水相加入0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 M pH 5.2乙酸钠,放置30 min，4 ℃，离心15 000 rpm,5 min去上清液。沉淀用70%冷乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20 ℃或4 ℃保存。 　　　1.3.2 PCR检测 　　三种方法制作的模板分别以PCR扩增。扩增结束后每EP管加入6×载样缓冲液10 μl，混匀。取10 μl混合DNA样品加入2%含溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm)30 min～40 min。紫外灯下观察结果并以凝胶成像系统保存图像。 　　2 结果 　　2.1 酚-氯仿法法与双蒸水煮沸裂解法的比较 　　两者相比较χ2=4.900 ，P=0.026 3 。Plt;0.05。差异有统计学意义。结果表明：酚-氯仿法提取DNA模板Uu阳性检出率高于应用双蒸水煮沸裂解法提取DNA模板的Uu阳性检出率,见表1。表1 酚-氯仿法与双蒸水煮沸裂解法扩增Uu的结果酚-氯仿法 双蒸水煮沸裂解法 （略） 　　2.2 酚-氯仿法法与PK法的比较 　　两