不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制.docVIP

　　不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的保护机制 铅是严重危害危害人类健康的一种重金属元素，铅暴露对人体各组织均有毒害作用，特别是免疫毒性[1].研究发现，铅暴露可导致免疫细胞数目锐减、生理活性及增殖能力降低，相关免疫蛋白合成速度降低，机体免疫功能受损[2-6].钙作为机体所需的常量元素，有研究表明摄入适量钙可干预铅对机体的免疫损伤[7-9],但是从细胞和分子角度调控机制不明确。本研究通过建立动物试验模型，从细胞和分子角度研究不同剂量钙对染铅大鼠免疫损伤的干预作用，从而为进一步阐明钙排铅的作用机制提供理论依据。 　　 　　1 材 料 与 方 法 　　 　　1.1 材料 　　 　　1.1.1 试验动物：雄性 SD 大鼠（出生 21 d,刚断乳幼鼠），平均体质量（50plusmn;5）g,共 60 只（北京维通利华公司）。 　　 　　1.1.2 主要试剂：Trizol 试剂、兔抗鼠 Ig G 血清、大鼠 Ig G 标准品、血清 Ig G 试剂盒、总 RNA 提取试剂盒、Prime ScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量试剂盒（南京建成）。其它试剂均为国产分析纯。 　　 　　1.1.3 主要仪器：D-3752 高速冷冻离心机[德国赛唯斯科技（Sigma）],DNM-9606 酶标分析仪（北京普朗新技术），HY-BM1160 分体式石蜡包埋机（武汉汉谷医疗科技生物），Mx3000P 实时荧光定 量 PCR 仪[美 国 安 捷 伦 （ Stratagene）],Eppendorf AG 核 酸 蛋 白 检 测 仪 [ 德 国 艾 本 德（Eppendorf）]. 　　 　　1.2 动物分组、饲养及样品采集 　　 　　将 60 只 21 日龄雄性 SD 大鼠适应性喂养约 7d 后，按体质量随机分成五组：对照组（去离子水+基础饲料）；染铅组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料）；试验Ⅰ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 0.5%碳酸钙）；试验Ⅱ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 1.0%碳酸钙）；试验Ⅲ组（0.2%醋酸铅饮用水+基础饲料添加 2.0%碳酸钙）。基础饲料（山西医科大学动物中心提供）中钙含量 4 g/kg,铅 0.02 mg/kg. 　　 　　所有试验动物均自由摄食和饮水，连续饲养60 d.喂养结束后，摘除眼球采集全血，一部分用于血细胞计数，一部分室温下倾斜静置半小时，4 ℃、2000 r/min 离心 10 min,得血清，冷藏备用；断颈椎处死动物，取脾脏并称重记录用以计算脏器指数；一部分脾脏样品迅速在液氮中冷冻后转移至于-80 ℃冰箱中保存，用于荧光定量 PCR 检测分析；另一部分保存于 40 g/L 多聚甲醛中固定，做切片备用。 　　 　　1.3 脏器指数 　　 　　脏器指数=脏器重（mg）/体重（g） 　　 　　1.4 细胞计数 　　 　　白细胞总数计数、白细胞分类计数、T 淋巴细胞计数方法参照文献[10]. 　　 　　1.5 大鼠血清中 Ig G 含量测定 　　 　　按试剂盒说明进行测定。 　　 　　1.6 脾脏切片制作及观察 　　 　　采集的脾脏组织固定 24 h 后，制备石蜡切片并进行常规 HE 染色，于显微镜下观察。 　　 　　1.7 Real-time RT-PCR 法检测脾脏中 TNF-alpha;、IL-1beta;、IL-6 m RNA 的相对表达量 　　 　　1.7.1 大鼠脾脏组织总 RNA 的提取及反转录：提取方法参照总 RNA 提取试剂盒，得到的 RNA 进行纯度分析之后参照试剂盒步骤进行反转录，c DNA于-80 ℃下保藏。 　　 　　1.7.2 引物设计：在 Gen Bank 中找到大鼠脾脏beta;-actin、TNF-alpha;、IL-1beta; 和 IL-6 的基因序列，通过 Primer5.0 plmu;s 软件设计试验所需引物，TNF-alpha; 上游引物 5#39;-ATGTGGAACTGGCAGAGGAG-3#39;,下游引物 5#39;-CGAGCAGGAATGAGAAGAGG-3#39;,产物大小 150bp;IL-1beta; 上游引物 5#39;-TGTTTGAG-CAGCAAGGACAC-3#39;,下游引物 5#39;-ACTAGGCGTAC-ATGGCAACC-3#39;,产物大小 138bp;IL-6 上游引物 5#39;-AGGAAAGGAAGGGATCAAGG-3#39;,下游引物5#39;-CAGCCTTAGCATGAGGGTTC-3#39; , 产 物 大 小96bp;beta;-actin 上游引物 5#39;-AGCCACCAATCCACA-CAGAG-3#39;,下游引物 5