与肿瘤细胞作用的活性药物分子筛选和分析方法构建.docVIP

　　与肿瘤细胞作用的活性药物分子筛选和分析方法构建 　　1 引言 　　 　　中药是我国传统医学的有益组成部分,是抗肿瘤制剂的重要。很多中药药物是由中药粗提物制备而成,然而,中药粗提物大部分含有成百上千种类型、结构和含量不同的成分,其有效成分通过多成分、多靶点、多途径发挥药效。这给药物筛选带来了极大的困难,使抗肿瘤药物的筛选成为研究中药抗肿瘤过程的关键环节。目前,关于荧光蛋白、微管蛋白、G-蛋白偶联受体、细胞膜、活细胞等与生物活性成分作用的文献已有报道。值得关注的是,由于细胞更接近体内生理环境,基于细胞的药物筛选方法,具有特异性高、可操作性强、可高通量等优点,已被广泛应用于药物靶点确证、吸收、分布、代谢和毒性研究。另外,在药物筛选的不同阶段,已出现了基于活细胞的微型和纳米级的分析技术。 　　 　　在体内环境下,所有的细胞均处于三维(3D)空间之中。二维(2D)培养的细胞,缺乏3D细胞支架来支持细胞生长和维持适当的组织功能,不能模拟体内微环境。3D培养的细胞,可以重现细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用,更能真实地反映细胞生长的微环境。在药物功效预测方面,一个更接近体内生理条件的体外模型能提供更可靠的数据。因此,细胞在3D条件下的响应更能代表其在体内条件下的响应,基于3D细胞的药物筛选方法将更有效。 　　 　　本研究旨在利用3D细胞反应器模拟体内微环境,建立一种与肿瘤细胞作用的活性药物分子的筛选和分析方法:(1)利用本实验室自制的丝素蛋白/胶原蛋白/纳米羟基磷灰石(SCH)复合多孔支架,构建了一个3D细胞反应器;(2)将人结肠癌细胞系Lovo细胞动态接种和灌流培养于3D细胞反应器中的SCH复合多孔支架上,并完成药物-细胞相互作用;(3)富集药物细胞作用后的流出液,用HPLC分析检测,筛选与肿瘤细胞特异性结合的成分。结果表明,这一方法具有高效、简便等特点,可用于与细胞特异性结合成分的筛选和分析,以及中药中候选药物的筛选。 　　 　　2 实验部分 　　 　　2。1 仪器与试剂 　　 　　XO-SM200超声微波联用仪(中国南京先欧仪器制造有限公司);Quanta200环境扫描电子显微镜(SEM,日本FEI公司);NikonTE2000倒置相差显微镜(IM,日本Nikon公司);LeicaTCSSP5激光共聚焦扫描显微镜(CLSM,德国Leica公司);LC-MS系统包括Agilent1100LC(美国Agilent公司)和BrukeQ6000MS(德国Bruke公司);冷冻干燥机(德国CHRIST公司);CO2孵育箱(德国Heraeus公司);Sillicell-PCF超纯水机(美国Millipore公司)。 　　 　　胎牛血清、DMEM、胰酶和DMSO购于Sigma-Aldrich公司;戊二醛购于Amersco公司;乙腈、甲醇(HPLC级)购于FisherScientific公司;白藜芦醇、紫杉醇标准品购于中国药品生物制品检定所。 　　 　　SCH复合多孔支架由本实验室自制;人结肠癌细胞系Lovo细胞购自中国典藏物培养中心(武汉);桃儿七购于西安药材市场,经陕西师范大学生命科学学院任毅教授鉴定。 　　 　　2。2 药品供试液的制备 　　 　　分别将白藜芦醇、紫杉醇、酮洛芬、青霉素G用DMSO溶解(DMSO最终浓度不能超过0。1%),经0。22mu;m滤膜过滤除菌后用PBS稀释至15mg/mL。 　　 　　将桃儿七粉碎,过筛。用甲醇在微波功率400SO溶解(DMSO最终浓度不能超过0。1%),经0。22mm滤膜过滤除菌后用PBS稀释至15mg/mL。 　　 　　2。3 色谱分析 　　 　　药物的HPLC分析在Shimadzu-10A液相色谱仪(主要由1个SPD-10AVP紫外检测器,2个10AVP泵,1个7725i进样阀,1个HT-220A柱温箱以及N2000工作站组成)上进行。色谱分离在AgilentSB-C18色谱柱上完成,检测条件如下:柱温25℃,流动相流速1。0mL/min,进样体积20mL。对于紫杉醇分析,流动相为乙腈(A)-水(B)(60:40),检测波长为227nm;对于白藜芦醇分析,流动相为甲醇(A)-0。5%甲酸水溶液(B)(45:55),检测波长为303nm;对于酮洛芬分析,流动相为乙腈(A)-0。02mol/LpH3。5KH2PO4水溶液(B)(60:40),检测波长为254nm;对于青霉素G分析,流动相为(A)-0。02mol/LpH2。5KH2PO4水溶液(B)(10:90),检测波长为220nm;对于桃儿七分析,流动相为乙腈(A)-0。04%甲酸水溶液(B),洗脱梯度为0~20min90%~77%B、20~40min68%B、40~65min59%B,检测波长为290nm。 　　 　　采用Ultimate3