三疣梭子蟹在氨氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的研究.pdf

三疣梭子蟹在氮氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的研究 三疣梭子蟹在氨氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的 研究 摘要 氨氮是养殖水环境中重要的污染胁迫因子。本文通过对三疣梭子蟹免疫相关 功能基因的克隆和表达研究，研究了氨氮胁迫对免疫相关指标、基因表达及代谢 指标的影响，初步探讨了三疣梭子蟹在氨氮胁迫下的免疫应答及解毒代谢机制， 主要包括三方面内容：(1)免疫相关基因抗菌肽erustin和抗脂多糖因子(ALF)、 溶菌酶、酚氧化酶原(proPO)、类a2．巨球蛋白(类a2．M)的克隆和表达分析； (2)氨氮胁迫对三疣梭子蟹免疫机能评价指标的影响；(3)氨氮胁迫对三疣梭 子蟹解毒代谢指标的影响。主要结果如下： 1三疣梭子蟹免疫相关基因的克隆与表达分析 通过RACE方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到两条抗菌肽基因crustin和 ALF，分别命名为Pterustin和PtALF。PtcrustineDNA全长584 bp，开放阅读框 (ORF)长333 bp，编码110个氨基酸，包括一个含21个氨基酸的N．端信号肽 eDNA全长1050 bp，ORF为372bp，编码123个氨基酸，包括一个26个氨基酸 的N．端信号肽和一个97个氨基酸的成熟肽，成熟肽理论分子量为l 1．35kDa，pI 1％； 4二硫核心(4．DSC)组成，Ptcrustin氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为52％．8 mRNA在血细胞中表达量最高，在胃中也有较高表达，在肝胰脏、肌肉、鳃和 心脏中表达量很低；而PtALF rnRNA在血细胞、肝胰脏、肌肉、鳃、胃和心脏 中均有较高表达。注射溶藻弧菌后Ptcrustin和PtALFmRNA表达均显著增加， 二者趋势基本一致，结果表明，注射溶藻弧菌能引起抗菌肽crustin和ALF基因 表达显著上调(氏O．05)，参与免疫防御反应。 通过RACE方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到一条溶菌酶基因。溶菌酶 eDNA全长984 bp，ORF为672bp，编码223个氨基酸，包括_个含18个氨基 三疣梭子蟹在氨氮胁迫下免疫应答与解毒代谢机制的研究 酸的N．端信号肽和一个含205个氨基酸的成熟肽，成熟肽理论分子量为 23．76kDa，pI为7．57。三疣梭子蟹溶菌酶氨基酸序列与其它虾类相似性为 75％．77％。同其它C．型溶茵酶一样，三疣梭子蟹溶菌酶两个非常保守的酶催化 位点Glu51、Asp69残基及8个保守的Cys残基，证明其为C一型溶菌酶；此外， Aspl04，说明其可能属于Ca2+结合C一型溶菌酶。实时定量PCR研究发现C．型溶 菌酶mRNA在血细胞中表达最高，在鳃、肝胰脏、肌肉中也有较高表达，在胃 h时显著降 和心脏中表达很低。注射溶藻弧菌后，C．型溶菌酶mRNA表达在3 低，3h后趋于稳定，并与对照组差异显著(尸O．05)；24h时C．型溶菌酶mRNA 表达显著上升，迅速恢复至对照组水平。 通过设计兼并引物，利用PCR方法从三疣梭子蟹血细胞中克隆得到一条 eDNA片段长551 proPO和一条类a2．M部分基因序列。proPO bp，编码183个 氨基酸序列；proPO氨基酸序列与其它虾蟹类相似性为73％-94％。克隆的proPO 部分氨基酸序列中含有1个保守的组氨酸残基及两个糖基化位点区域，分别是 eDNA片段长2685 Asn．Ser-Asn(NSN)和Asn．Thr．Leu(NTL)。类睨．Mbp， 165 3UTR为1