铁离子负荷下青篙琥酯对胰腺癌细胞株PANC-1增殖抑制及促凋亡水平的影响.pdfVIP

硕士学位论文 第一章前言 药物在我国的使用已有上千年的历史．，在70年代我国科学工作者首次从黄花蔫 其衍生物除抗疟疗效外，尚具有抗肿瘤效果its]，体内、外实验证实对小鼠艾氏腹 种恶性细胞株均有一定细胞毒作用。并且观察其抗肿瘤作用具有如下特点：1、抗 癌机理不同与传统化疗药物；2、 与目Iii『临床化疗药无交叉耐药性；3、在铁离 子负荷条件下青蒿类药物抗肿瘤效果有所增强【25l。对于此点是有争议的。支持者 的解释为：与抗疟机制相似细胞内铁离子的存在可以催化青蒿素类药物产生氧自 由基导致细胞毒作用，引起细胞死亡．在无铁离子情况下青蒿类药物较稳定。同 硕士学位论文 第二章材料与方法 第二章材料和方法 1．胰腺癌细胞株(PANC-1)：购于中科院上海生物研究所细胞库 2．药物及试剂： 2．1药物： 青篙琥酯(axtesunate，ART)购于中国广西桂林南药股份有限公司(国药准字 5％碳酸氢钠lml配成储备液，．4c冰箱保存。实验时用DMEM液稀释所需浓度， 并使碳酸氢钠的终浓度小于0．09％；乳酸亚铁胶囊：(海南通用同盟药业有限公 充分溶解后过滤离心，-4℃保存备用。 2．2试剂： ’≮ ”‘ 细胞培养： 1．DMEM(购于美国Hyclone公司)，500mV瓶 rain灭活 2．10％小牛血清(购于杭州四季青生物工程材料有限公司)，56℃水浴30 后分装，．20℃保存备用 3．青霉素及链霉素， (购于长沙千金药业) 上充分溶解后，置4℃保存，使用期限不超过15天 5．--I甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司产品，4℃保存，使用时室温溶解 装，-4℃保存备 3． 主要仪器设各： 超净工作台(上海净化设备厂) 二氧化碳孵箱(HARRIS美国) 倒置显微镜(Nikon本) 低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂LDZ5) Cov删15日本) 光学显微镜(Olympus 流式细胞仪(FACScan美国B．D公司) 硕七学位论文 第二章材料与方法 1000 微量振荡器(RosiTM德国) 培养瓶(Coring美国) 培养板(96孔及6孔)(Costar美国) 4．实验方法： 4．1细胞培养： 用含10％：b牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％的C02孵箱中培养。在 细胞处于对数生长期并长至瓶底80％．90％面积分数时，用0．25％胰酶消化5分钟 后，吹打并加DMEM培养基制成单细胞悬液，进行细胞计数即可接种或传代。 4．2 MTT法检测青篙琥酯对胰腺癌细胞增殖的抑制作用： 4．2．1原理及步骤： (1)原理：为Mosmann首创‘281，利用活细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酸酶可将 外源性的MTT还原成难溶性的紫色结晶一甲替(formazan)，而死亡细胞不具有 此功能，以此形成与死亡细胞的功能差别。然后利用二甲亚枫(DMSO)溶解细胞 中的紫色结晶，溶解的量的不同使液体的终颜色深度形成差异。在光度仪600rim 波长处测其吸光度值(A600)，以空白作为对照。由于MTr结晶物形成的量(以吸 光度值表示)与细胞数成正比，可以间接反映增殖细胞的数量。利用此原理测定 抗肿瘤药物作用后的胰腺癌细胞(A600)值变化，并计算出肿瘤细胞存活率，从而 了解肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感程度；．(2)步骤：以一定浓度(接种浓度需实验确 定)的细胞加入96孔板中，200ul／孔。在预定的时间取出培养板，吸去各孔培 放回C01孵箱中再培养4小时后，弃上清液，加DMS0200ul／孔，振荡器上振 荡5．IO分钟，空白调零，在读数仪中测出每孔在600mn处的-k-k吸光度值。 4．2．2最佳接种浓度及接种时间的确定： 取对数生长期的胰腺癌细胞用0．25％胰酶消化后，DMEM培养基制成单细 1