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维普资讯 植物生理学通讯 第40卷 第 1期，2004年 2月 75 一 种利用普通垂直电泳槽回收PAGE胶蛋白条带的简便方法 王东辉 韩 韬 龚化勤 张 力 白书农 北京大学生命科学学院，北京 100871 ASimpleM ethodforProteinRecoverywiht OrdinaryElectrophoresisApparatus WANGDong-Hui，HAN Tao，GONGHua-Qin，ZHANGLi，BAIShu-Nong CollegeofLfieScwnce~PekingUniversity，Beijing100871 提要 植物总蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之后，直接用考马斯亮蓝染色、切胶回收目的条带，再用聚丙烯酰 胺凝胶 电泳槽电洗脱纯化得到单一条带的 目的蛋白。此法可得到有活性的黄瓜衰老叶片中被特异激活的DNA酶，对样 品中含量少，特别是与其他分子量相近的蛋白质十分有效。 关键词 蛋 白质纯化；电洗脱；DNase 最近我们在研究黄瓜单性花发育分子机制时 Lamt的方法获得。材料用液氮冷冻、在研钵中 发现，雌花雄蕊中出现特异的、与叶片衰老时 磨碎后，每克加入 1mL提取缓冲液[10ommolL· 出现的DNA酶活性相 同的蛋 白1【]。如何分离这一 3．(Ⅳ．吗啡啉)乙磺酸(Mops)，pH 6．8；5mmol· 区域 中特异激活的DNA酶成了急需解决的问题 。 L 抗坏血酸盐；2mmolL· 还原性谷胱苷肽；1 常用的层析和 电泳方法对我们的实验有一些 困 mmolL· 氯化钙；1mmolL· 氯化镁；0．5mmol· 难 。前者需要的样品量大，而黄瓜幼花本身很 L。苯 甲基磺酰氟 (PMSF)：10mmolL· 氯化锌】浸提 小，要取其 中包含雄蕊的区域所得到的样品量更 2h，离心后以12000×g于4℃下离心 10min，上 少，难 以用于 目的蛋 白的纯化 。后者虽然可 以 清液即为粗蛋 白。 用于少量材料的蛋 白分析，但从复杂的蛋白条带 2．2 蛋白质的分离与分析 SDS．PAGE方法主要 中分离出目的条带常用的活性染色方法2【，引，由于 按照文献4方法进行。浓缩胶4％，分离胶 l2％。 其分辨率低，很难准确分离出 目的条带。为了 电泳槽用BioRadMini3型。氯化钾染色用预冷的 解决这一 问题，我们尝试在以PAGE胶从样 品中 0．5mo1．L。KC1染SDS．PAGE胶 5mini2,31。考马 分离蛋 白之后，直接用常规的考马斯亮蓝染色， 斯亮蓝染色、脱色也按照文献 5进行；振荡染色2 切胶回收 目的条带，再用常规的PAGE胶 电泳槽 h (100mL染色液：0．25g考马斯亮蓝、45mL 电洗脱纯化 目的蛋白，成功地从雌花雄蕊区域和 甲醇、45mL水、10mL冰醋酸)，用脱色液 衰老叶片中得到了纯化且具有相 同活性的DNA (1oomL脱色液：45mL甲醇、45mL水、10mL 酶。现介绍如下。 冰醋酸)脱色直至背景清晰。 2．3 电洗脱纯化目的蛋白 将含 目的蛋白的凝胶切 材料与方法 下后装入合适的透析袋中，加入 1mL电洗脱液 1 试剂 (50mmolL·～Tris、50mmolL· 甘氨酸、0．1％ Tris、SDS、甘氨酸等蛋 白电泳试剂购 自北 京化学试剂公司；低分子量标准蛋白购 自上海东 收稿 2003．01．17 修定 2003．06．06 风试剂公司。 资助 国家攀登预选项 目(J00．A．005．和国家