微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化.doc

实验一 产酶微生物的分离、纯化与选育 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化 2.1 实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。 2.2 实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 2.3 实验仪器与材料 土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 2.4 实验方法与步骤 2.4.1 分离 1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液； 2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌； 3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h； 4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 2.4.2 筛选 1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。 2.5 实验结果 在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。 1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值）结果。 2.6 注意事项 1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；2）点接含酪蛋白的平板时，接种量及接种面积要基本相同。 2.7 分析与讨论 在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活力测定。 2.8 思考题 1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；2）蛋白酶有哪些方面的应用。 参考书目 [1] 扬文博，微生物学实验.北京:化学工业出版社，2004. [2]黄秀梨、辛明秀主编，微生物学实验指导，高等教育出版社，2008年. 附：相关培养基 1酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，水100mL， pH 7.6-8.0。配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。 2产蛋白酶发酵培养基：玉米粉 6.0g，豆饼粉 4.0g，Na2HPO4 0.4g，KH2PO4 0.03g，Na2CO3 0.1g，自来水100 mL，pH 9.0(灭菌前)。配制方法：称取玉米粉3g、豆饼粉2g，置于洁净干燥的500mL锥形瓶中，轻轻摇动，使物料混匀。按上述配方用自来水配置无机盐溶液50mL，调pH值，倒入装有物料的锥形瓶中，混匀，0.1MPa压力，灭菌30min。 3淀粉培养基：牛肉膏0.5 g，可溶性淀粉0.2 g，蛋白胨1.0 g，琼脂 2.0 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水100 ml，pH值 7.2-7.4。配制方法：先用少量蒸馏水将可溶性淀粉在沸水浴中煮融，至淀粉液透明，补足水量，将其他成分溶入，调pH值， 0.01 MPa压力，灭菌30 min。 4产淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8.0 g，蛋白胨 0.5 g，豆饼粉 4.0 g，K2HPO4 0.5 g，(NH4)2SO4 0.4 g，蒸馏水100 ml，自然pH，0.05 MPa压力，灭菌30min。 4. 产酶微生物菌种的选育 生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因