果酒酿造实验报告.docVIP

果酒酵母的分离纯化和选育 一、实验目的和内容 1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法； 2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。 二、实验原理 酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。 三、实验仪器与材料 样品：新鲜水果榨汁。 YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. PDA培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121℃灭菌30分钟。） PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。 器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。 配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品将腐果装将富集培养液各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。 2．酵母菌种的复筛选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 ℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。 发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 ℃下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。 3．酵母菌的耐受性试验采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16% 、18% 、20% ）、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。 活化条件：28 ℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h 发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d； 接种量：1×107 cfu/mL。 1）耐酒精度试验采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml， 再以水果原汁为培养基， 制成含酒精量为10%、12%、14%、16% 、18%系列的液体培养基。 按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量： 试管编号 0 10 12 14 16 18 20 95%酒精/mL 0 1.05 1.26 1.4 1.68 1.90 2.15 果汁/mL 10 8.95 8.74 8.60 8.32 8.10 7.85 培养液含酒精%（v/v） 0 10 12 14 16 18 20 耐SO2试验按亚硫酸含量为6% 计， 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培