食品中单增李斯特菌检测.docVIP

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食品中单增李斯特菌检测

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测 实验目的 1)了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。 2)熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。 基本原理 单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。李斯特菌是一种细胞内寄生菌,它不仅可能存在于肉类产品中,也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中,在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。据报道,健康人粪便中该菌的携带率为0.6%~16%,4%~8%的水产品、5%~10%的奶及其制品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。李斯特菌能在1~45℃的温度下生存,能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。 该菌为革兰氏阳性短杆菌,有的菌体略弯曲,两端钝圆,大小约为0.4~0.5μm ′ 0.5~2.0μm。多单在,有时是V字型排列。 无芽孢,不产生荚膜。在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6~20μm或更长的丝状。在20~25℃培养时可产生2~4根鞭毛而运动,但在37℃培养时鞭毛发育不良,无运动性。 本菌需氧或兼性厌氧,生长温度为1~45℃,最适温度为30~37℃。对营养要求不高,可在普通琼脂培养基中生长,但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。加入0.2%~1%(W/V)的葡萄糖及2%~3%(V/V)的甘油生长更佳。在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。在4℃可缓慢增殖,形成菌落约需7d。 在液体培养基中培养18~24h后,肉汤呈轻度均匀混浊,数天后形成粘稠沉淀附着于管底,摇动时沉淀呈螺旋状,继续培养可形成颗粒状沉淀。不形成菌环、菌膜。 在营养琼脂上,光滑(S)型可形成直径0.5~1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落,斜射光照射时,菌落呈特征性蓝绿光泽。粗糙(R)型菌落表面起伏不平,边缘不整齐,细菌难以乳化。 在血液琼脂培养基上,可形成狭窄的β-溶血环,常不超出菌落边缘,移去菌落才可见。弱溶血或疑似溶血菌株可用协同溶血试验(CAMP)鉴定。 半固体培养基:沿穿刺线呈云雾状,随后缓慢扩散,在培养基表面下3~5mm处呈伞状。 该菌接触酶阳性,氧化酶阴性。能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨糖,不发酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纤维二糖和侧金盏花醇。不利用枸橼酸盐。不还原硝酸盐,不产生靛基质和硫化氢。甲基红及VP试验呈阳性。不液化明胶和凝固血清。可水解七叶苷和马尿酸钠。 实验材料 仪器 恒温培养箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃;均质器;显微镜:10×~100×;电子天平:感量0.1 g ;锥形瓶:100 mL、500 mL;无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度);无菌平皿:直径90 mm; 无菌试管:16 mm×160 mm;离心管:30 mm×100 mm;无菌注射器:1 mL;金黄色葡萄球菌(ATCC25923);马红球菌(Rhodococcus equi) 单增李斯特氏菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、英诺克李斯特氏菌(L.innocua) 培养基和试剂 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE);含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE);李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2);盐酸吖啶黄(acriflavine HCl)溶液:见附录A 中A.3.2.1;1 %萘啶酮酸钠盐(naladixic acid)溶液;PALCAM 琼脂;革兰氏染液;SIM 动力培养基;缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P 试验用];5 %~8 %羊血琼脂:;糖发酵管;过氧化氢酶试验;李斯特氏菌显色培养基。 样品:鲜肉、鲜奶、蔬菜等 实验内容 实验路线图: 1 增菌 以无菌操作取样品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续 均质1 min~2 min;或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均质杯中,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2min。于30 ℃±1 ℃培养24 h,移取0.1 mL,转种于10 mL LB2 增菌液内,于30 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。 2 分离 取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上,于36 ℃±1 ℃培养24 h~48 h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色

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