基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭性质的核酸检测方法.docVIP

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭性质的核酸检测方法 　　摘要将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合，构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸（HP1和HP2）。由于两条探针核酸具有3′粘性末端， 使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解，因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光。当目标DNA存在时，会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应，并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片。在优化条件下，目标DNA浓度在0.5～6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系，检出限为0.28 pmol/L。与单重信号放大技术相比，本方法极大改善了分析灵敏度和检出限，且具有良好的单碱基错配区分能力。 　　关键词DNA传感器； MoS2纳米片； 核酸外切酶Ⅲ； 双重信号放大； 荧光猝灭 　　1引 言 　　特定序列核酸的检测在病原感染、遗传疾病、法医鉴定以及现代生命科学发展等方面具有重要作用[1～5]。发展灵敏度高、准确性好且简单、快速的核酸检测方法仍然是目前生物分析研究的热点[6，7]。目前，许多信号放大技术已广泛应用于DNA检测中，诸如核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ， Exo Ⅲ）诱导的信号放大[8～10]、DNA聚合酶诱导的信号放大[11～13]、杂交链式反应的信号放大[14～17]及滚环复制诱导的信号放大[18～22]等。其中，Exo Ⅲ能够无序列选择性地将双链DNA的3′末端剪切成单核苷酸，因而成为一种极为常用的信号放大工具[23，24]。Exo Ⅲ这种独特的性质使其广泛应用于核酸[8～10，23，24]、蛋白质[25，26]及其它物质[27，28]检测中。Cai等[10]开发出了一种基于Exo Ⅲ的双重放大技术，用于核酸检测。与单重信号放大技术相比， 该方法极大提高了检测灵敏度，并有较好的碱基错配分析能力。 　　MoS2纳米片是一种与石墨烯具有类似结构的二维纳米材料，其独特的纳米电子学性质、光电子性质及电子捕获能力使其成为重要的能量转移受体[29，30]。与石墨烯相比，MoS2纳米片更易于大规模制备， 且无需处理即可直接分散于溶液中[31，32]。同时，MoS2纳米片可与荧光染料修饰的单链核酸结合并猝灭其荧光。这一独特性质使其能够用于构建快速、高灵敏且低成本的生物传感器[33～35]。然而，基于MoS2纳米片的生物分析方法仍然较少[36]。 　　原发性血色病是一种常染色体隐性遗传疾病，致使铁调节相关激素的缺陷，造成胃肠道过度吸收铁，随后沉积在肝脏、胰腺、心脏、关节、皮肤和性腺，最终引起各器官功能的损害，而在人类遗传性血色病中，HFE基因蛋白的突变是最常见的原因[37]。本研究将Exo Ⅲ诱导的双重放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质相结合，用于人血色病（Human hemochromatosis， HFE）特异性序列的检测中。当目标DNA存在时，会促使Exo Ⅲ启动双重放大反应，对两条发夹结构的荧光探针核酸（Hairpin probe 1 and hairpin probe 2， HP1 and HP2）降解，并产生大量荧光基团碎片，且这些碎片因不能吸附于MoS2纳米片表面而使其荧光恢复。本方法由于引入MoS2纳米片，不仅降低了检测背景，且极大降低了荧光探针的用量，进而降低了检测成本。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　RF5301PC 型荧光光谱仪（日本Shimadzu 公司），激发波长480 nm，激发和发射狭缝宽度均为10 nm。 PB10 酸度计（德国Sartorius公司）。SPA400原子力显微镜（AFM），SPI3800控制软件（日本Seiko Instruments Industry公司）。JEM1200EX透射电子显微镜（TEM，日本电子公司）。 　　缓冲溶液由20 mmol/L Tris， 300 mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2配制，并用HCl调节至pH 8.0； MoS2纳米片（南京先丰纳米科技公司）； Exo Ⅲ（Takara公司）； 其它试剂均为分析纯； 实验用水均为去离子水； 所有核酸均由上海生物生工有限公司合成，其序列见表1。 　　2.2样品检测 　　将2.0 nmol/L HP1、8.0 nmol/L HP2、待测样品和Exo Ⅲ混合，并用缓冲液补足至200 μL，并在37℃下孵育一段时间后，加入适量MoS2纳米片，并用缓冲液补足至400 μL。在激发波长为480 nm，发射波长为520 nm的条件下，测定上述溶液的荧光强度。所有实验均重复3次。 　　3结果与讨论 　　3.1实验原理 　　本方法的检测原理如图1所示：