3细胞生和物学研究方法.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 本章重点 细胞形态结构的观察方法——各种显微镜技术 细胞组分的分析方法： 离心技术、化学组分分析技术、免疫技术、原位杂交技术、放射自显影技术、定量细胞化学分析技术等 了解细胞工程相关技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大设计倍数为1000X。 （二）相差显微镜 光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜 的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差板。 原理 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 荧光共振能量转移技术（FRET） 技术原理 ：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。 （一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEM 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 第二节 细胞组分的分析方法 原代培养 （primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养（Passage）。 细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 表三、实验室中常用的几种细胞系 基因克隆技术 转基因生物 Gene Chip 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 病毒 细菌 酵母 线虫 果蝇 斑马鱼 小鼠 拟南芥 人 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 1，植物细胞