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Ames试验 简介 Ames试验全称：污染物致突变性检测 Ames BN等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。 该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。 应用： 检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性； 有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施； 或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据； 有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类； 检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害； 用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据； 检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患； 用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等。 目的和原理 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）组氨酸营养缺陷型菌株（his－ mutant） 在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。 供试菌株和鉴定 菌株鉴定 用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。 目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。 鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于37℃，100r／min振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为1×109个／ml～2×109个／ml。 鉴定的项目 脂多糖屏障丢失（rfa）：用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱，培养24h后观察结果。 R因子： 划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿的药液不同，为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1，载有抗四环素的基因，故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。 紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）：在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。 自发回变： 预先制备底平板，向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。 回变特性—诊断性试验 ：上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。 组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。 步骤和方法 Ames试验的常规方法有： 斑点试验 平板掺入试验 斑点试验 吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4ml S9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。 用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。 结果： 在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性； 菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。 平板掺入试验 将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml－0.4ml S9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。 试样通常设4个～5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。 同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。 MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。 * *