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乙酰丁香酮和共培养pH对黄瓜遗传转化效率影响 　　摘 要： 以黄瓜品种长春密刺子叶节为外植体，研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方式、浓度及共培养pH对黄瓜遗传转化的影响。结果表明：在侵染菌液和共培养基中加入AS均可显著提高黄瓜抗性芽诱导率，浓度以100 μmol·L-1为最佳。共培养基的pH 对黄瓜抗性芽诱导率也有影响，其中在pH 5.2的共培养基上黄瓜转化率最高。研究结果优化了黄瓜遗传转化体系，提高了黄瓜转化效率，为推动黄瓜转基因工作奠定了坚实的基础。 关键词： 黄瓜； 遗传转化； 乙酰丁香酮； pH 黄瓜（Cucumis sativus L.）是一种重要的经济作物，在全世界范围内有较大的种植面积。黄瓜遗传基础狭窄，种质资源较少，很多重要的遗传性状无法通过有性杂交的手段来改良。因此，基因工程技术就成为对常规育种的有效补充手段。农杆菌介导的子叶节法是黄瓜转基因中最为常用的方法[1]，目前已通过这种方法将iaaM[2]、BnCS[3]及opd[4]等基因转入到黄瓜当中。但目前这种方法应用的最大瓶颈是黄瓜的再生困难、转化效率低，因此如何提高黄瓜的转化率，建立稳定、高效的转化体系是黄瓜遗传转化过程中急需解决的问题。 乙酰丁香酮（AS）是宿主细胞分泌出的一种酚类化合物，它可以通过增强农杆菌的侵染效果来提高基因的转化效率。目前在水稻[5]、辣椒[6]及杨树[7]等多种作物的基因转化过程中都会添加一定浓度的AS来提高转化效率。AS的作用效果受多种因素的影响，如植物种类、AS的添加方式和浓度、菌株和载体类型、共培养pH及对AS产生协同作用的物质等[8]。其中AS的添加方式和浓度及共培养pH是较为重要的3个因素，探讨这三者对黄瓜转化率的影响对于优化黄瓜遗传转化体系具有十分重要的意义，而目前这方面的研究还未见报道。 本文以黄瓜品种长春密刺为试材，就AS的添加方式、浓度及共培养pH对黄瓜遗传转化效率的影响进行了探讨，以明确AS在黄瓜遗传转化过程中的使用条件和方法及最佳共培养pH，建立稳定、高效的黄瓜遗传转化体系，为提高黄瓜转化效率、推动黄瓜转基因工作的前进奠定坚实的基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料 南京农业大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室保存的华北型黄瓜长春密刺的高代自交系。 1.1.2 菌株和质粒 所用农杆菌菌株为EHA105（Rif R，Kan R），由本实验室保存和提供。植物表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3由本实验室构建，载体上携带标记基因HYG（潮霉素）、目的基因CsCBF3[9]、GUS基因、GFP基因，CaMV35S启动子及NOS终止子，图谱如图1所示。 图1 植物表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3的 T-DNA区图谱 1.2 方法 1.2.1 农杆菌-子叶节法转化黄瓜 试验于2012年3月在南京农业大学进行。选取饱满的长春密刺种子，在0.1% 的升汞溶液中消毒灭菌8 min，无菌水冲洗4～6次后用滤纸吸干表面水分，然后接种在MS培养基上。（25±2）℃ 条件下暗培养2 d后转至光下继续培养，4～5 d后切取子叶节，接种在预培养基上黑暗中预培养2 d。 挑取携带表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3的农杆菌EHA105单菌落，接种于YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif液体培养基中，28 ℃条件下震荡培养16 h。离心后弃去上清液，加入MS0液体培养基重悬至OD600为0.6作为侵染液。将经过预培养的黄瓜子叶节置于MS0农杆菌菌液中侵染10 min，吸干菌液后接种在共培养基上，暗培养3 d后转接至选择培养基上，每2周继代培养1次。 1.2.2 乙酰丁香酮处理 1）侵染菌液中加入乙酰丁香酮：在MS0农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮，使终浓度分别为0、50、100、150、200 μmol·L-1，低速震荡培养1 h以活化农杆菌，然后将其作为侵染菌液用于侵染，每处理3次重复。2）共培养基中加入乙酰丁香酮：试验采取两因素正交设计，将共培养基pH分别设为4.9、5.2、5.5、5.8，在每个pH水平上分别添加乙酰丁香酮至终浓度分别为0、50、100、150、200 μmol·L-1，以未添加AS的MS0农杆菌菌液为侵染液，每处理3次重复。 1.2.3 数据统计及分析 抗性芽在选择培养基上进行继代培养，继代2～3次（选择培养30 d）后统计长芽外植体数与总外植体数。将抗性芽诱导率（用产生抗性芽的外植体数与总外植体数的比值的百分率表示）作为评价黄瓜转化率的指标。利用SPSS 20.0软件对数据进行均值、标准差计算及显著性方差分析。 2 结果与分析 2.1 侵染菌液中添加AS对