一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增多态性(RSAP)的建立及优化.pdf

第34卷第9期 西北农林科技大学学报(自然科学版) V01．34NO．9 2006年9月 Jour．ofNorthwestSci—TechUniv．of For．(Nat．Sci．Ed．) Agri．and Sep．2006 一种新型DNA标记技术——限制性位点扩增 、 多态性(RSAP)的建立与优化 杜晓华1’2，王得元2，巩振辉1 (1西北农林科技大学园艺学院，陕砥杨凌712100； 2广东省农业科学院蔬菜研究所广东省果蔬新技术研究重点实验室，广东广州510640) [摘要]为了避开基于限制性酶切位点分子标记技术的DNA酶切环节，简化其复杂的程序，试验以辣椒为材 料，建立了一种新型DNA标记技术一一限制性位点扩增多态性(RSAP)，并对其反应体系进行了优化，对RSAP适 用性、重复性进行了检验。结果显示，RSAP技术的引物为2条长度均为18bp的引物，引物的37端为4～6个碱基的 限制性酶切位点序列，接着是12～14个碱基的随机序列，2条引物的限制性位点和随机序列不同；PCR扩增的前5个 循环采用35C的退火温度，随后的35个循环采用48 C的退火温度；在25pI。反应体系中，模板DNA用量为20ng， Mg”浓度为2．5mmol／I。，dNTPs浓度为0．2 DNA聚合酶用量为1．5U，2条引物浓度均为600 mmol／I。，Taq nmol／I．；RSAP技术重复性好，适用性广泛，是一种操作简便、产率中等、稳定可靠的DNA标记技术。 [关键词]限制性位点扩增多态性；DNA标记技术；蔬菜育种 [中图分类号]$603．2 [文献标识码]A [文章镧号] 作为一种遗传标记，DNA标记因具有数量多、 序复杂、步骤繁琐等不足，整个过程包括了基因组 多态性高、可直接反映基周组+DNA等优点，已被应一DNA或cDNA的酶切，寡核苷酸衔接子的连接，连 用于生物遗传多样性分析、连锁图谱构建和重要基 接片断的选择性扩增等。其中DNA不完全酶切时， 因的标记等方面。然而DNA标记的广泛应用和深 采用甲基化不敏感的酶会导致检测时带型不一致， 入推广有赖于DNA标记技术的不断发展与改进。 影响AFI。P指纹分析的准确性；采用甲基化敏感的 操作简便、多态性丰富、产率中等、结果稳定可靠和 内切酶，基因组的甲基化又会导致假多态性出现[2]。 成本低廉，已成为分子标记技术的发展方向。基于生 其他一些改良的AFLP技术，虽然不同程度地增加 物基因组上广泛分布的限制性内切酶识别位点(简 了检出的多态性或简化了步骤，但仍离不开限制性 称限制性位点)，BotsteinD等[1]创建了限制性片断内切酶酶切和随后的复杂步骤[31]。为了进一步改进 长度多态性(Restriction poiymor— Iragmentlength 技术，本研究通过设计独特的引物和PCR扩增程 phism，RFLP)标记技术，该技术通过克隆的杂交探 序，建立了一种新型的无需限制性酶切及其他复杂 针来检测限制性位点之间的多态性，具有稳定可靠、 步骤，仅一个简单PCR即可实现对nNA限制性位 共显性等优点，但其中的Southen杂交耗时费力，使 点多态性进行检测的DNA标记技术，命名为限制 si‘te 其广泛应用受到一定限制。此后，伴随着PCR