黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达.pdfVIP

微生物学通报 May 20, 2017, 44(5): 1065−1073 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160564 研究报告 黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的 高效表达 李兵 蔡国林 朱德伟 陆健* ( 214122) 摘 要：【目的】对黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因进行克隆和密码子优化，使其在毕赤 酵母(Pichia pastoris X-33) 中高效表达。【方法】以黑曲霉基因组为模板，经重叠延伸PCR 扩增得 到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA) ，并对AnfaeA 基因进行毕赤酵母密码子偏好性“随机优化”和“一对一 优化” ，全基因合成后分别与表达载体 pPICZαA 连接，构建表达载体 pPICZαA-AnfaeA 、 pPICZαA-opAnfaeA I 和pPICZαA-opAnfaeA II 。经Sac I 线性化后电转化至P . pastoris X-33 中， 筛选阳性转化子。摇瓶发酵4.5 d 后，测定并比较重组阿魏酸酯酶(reAnfaeA)酶活。【结果】密码 子优化前阿魏酸酯酶酶活为6.8±0.1 U/mL ，基因“一对一优化”和“随机优化”后的重组酶酶活分别 为5.2±0.1 U/mL 和39.9±0.1 U/mL ，“随机优化”后酶活比优化前提高了近6 倍，而“一对一优化” 后酶活仅为优化前酶活的76.5%。重组阿魏酸酯酶的最适pH 为5.5 ，且在pH 4.5−7.0 稳定性较 好；最适反应温度50 °C ，在45−50 °C 较稳定。【结论】阿魏酸酯酶基因经密码子“随机优化”后 进行重组表达，酶活显著提高，对研究阿魏酸酯酶在毕赤酵母及其它宿主中的高效表达具有一定 的借鉴意义，也为大规模工业化应用奠定了基础。 关键词：黑曲霉，毕赤酵母，阿魏酸酯酶，密码子优化 Codon optimization of feruloyl esterase gene of Aspergillus niger and its high expression in Pichia pastoris * LI Bing CAI Guo-Lin ZHU De-Wei LU Jian (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: [Objective] Gene cloning and codon optimization of the feruloyl esterase from Aspergillus niger (AnfaeA) for its inducible expression in Pichia pastoris X-33. [Methods] The AnfaeA gene was Foundation item: National High Technology Research